Caractérisations biophysiques et structurales du complexe de réplication des Rhabdoviridae

par Francine Gérard

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Rob W. H. Ruigrok et de Marc Jamin.

Soutenue en 2008

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015) .

mots clés

Résumé

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sert de modèle pour l'étude de la multiplication des virus (Mononegavirales) alors que la rage(RV) reste un sérieux problème de santé publique. Le génome de VSV et RV code notamment la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). N s'associe étroitement à l'ARN viral. Ce complexe N-ARN sert de matrice pour la réplication et la transcription virale. P est le cofacteur de la polymérase virale (L) et chaperonne N. En interagissant avec N-ARN (domaine C-terminal) et avec L (domaine N-terminal), P assure le lien physique entre l'ARN viral et L. La stœchiométrie de P, sa structure et son rôle exact pendant la transcription et la réplication restent incertains. Mon travail a consisté à une caractérisation biophysique et structurale de P et des complexes N-ARN-P pour mieux comprendre la dynamique du complexe de réplication de ces virus. L'analyse biophysique montre que P RV & VSV existent sous forme de dimère allongé en solution. L'analyse bioinformatique a révélé une organisation modulaire, confirmé par des études biochimiques et biophysiques de mutants de P RV. La structure du domaine C-terminal de P VSV a été résolue par RMN et montre une homologie celle du C-ter de P RV. La caractérisation de l'interaction entre P et les anneaux N-ARN a révélé l'existence de deux types de complexes N-ARN-P (contenant un et 2 dimères de P par anneau). L'étude par ME des complexes nucléocapsides-P a permis de mettre en évidence un changement de conformation important. Pour devenir accessible à L, l'ARN viral doit se dissocier localement de N. L'interaction N-ARN-P représente potentiellement une nouvelle cible pour le développement d'antiviraux.

Titre traduit

Biophysical and structural studies of the replicative complexe of Rhabdoviridar

Résumé

Vesicular stomatitis virus (VSV) serves as a model for studying the multiplication of viruses (Mononegavirales), whereas rabies (RV) is still a serious health problem. VSV & RV genomes encode in particular the nucleoprotein (N) and the phosphoprotein (P). N binds to the viral genome forming an N-RNA complex that serves as a matrix for viral transcription and replication. P is a cofactor of the viral polymerase (L), and a chaperone of N. P binds to N-RNA (C-terminal domain) and to L (N-terminal domain), making a physical link between the viral genome and L. The stoechiometry, the structure and the exact functions of P oligomers are controversial or unknown. The aim of this work was to undertake a structural and biophysical characterization of P and of the complexes that it forms with N-RNA in order to understand the dynamic of the replicative complex of theses viruses. Biophysical studies of RV & VSV P show that these proteins behave as elongated dimers in solution. Bioinformatics analysis indicates a modular organisation of P, confirmed with biochemical and biophysical datas of RV P mutants. Structure of the C-terminal domain of VSV P was solved by NMR showing a homology with the C-terminal domain of RV P. Characterization of the interaction between P and N-ARN rings complexes revealed two forms of N-RNA-P complexes, with one and 2 dimers of P. Structural analysis with electron microscopy of the nucleocapsid-P complexes revealed an important conformational change. The viral genome must dissociate locally from N to allow the viral polymerase to access to the genome information. The N-RNA-P interaction is an interesting target for drug design as it only exists in viruses.