Régulation différentielle du canal sodium dépendant du potentiel Nav. 1. 1 par la calmoduline et le calcium : une cible potentielle de mutations pro-épileptiques
par Christelle Gaudioso
Thèse de doctorat en Neurosciences
Sous la direction de Gisèle Alcaraz.
Soutenue en 2008
à Aix-Marseille 2 , en partenariat avec Laboratoire de neurobiologie des canaux ioniques (Marseille) (laboratoire) .
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Résumé
L’isoforme Nav1. 1 du canal sodium dépendant du potentiel est localisé dans le compartiment somato-dendritique mais également dans le segment initial et le long de l’axone des interneurones à parvalbumine de l’hippocampe et du cortex. L’identification de nombreuses mutations de ce canal impliquées dans des syndromes épileptiques de sévérité variable souligne son rôle important dans le contrôle de l’excitabilité. Nous avons mis en évidence que Nav1. 1 est régulé de manière différentielle par la calmoduline (CaM) et le calcium dans la lignée stable HEK-Nav1. 1. La CaM augmente l’amplitude du courant sodium uniquement en présence de calcium. Elle déplace également la courbe d’activation vers des potentiels hyperpolarisés et accélère l’inactivation indépendamment du calcium. Nos travaux suggèrent que le lobe C de la CaM interagit avec la partie proximale du motif IQ dans le domaine C-terminal même en l’absence de calcium et que l’intégrité du motif IQ est indispensable à cette liaison. En présence de calcium les deux lobes de la CaM interagissent avec le domaine C-terminal du canal avec un site de fixation pour le lobe N dans la partie distale du motif IQ. Contrairement à la CaM, le calcium ne module pas la densité du courant Nav1. 1 et déplace positivement la courbe d’inactivation. Nous avons également observé une régulation opposée à celle de la CaM : un déplacement positif de l’activation qui est contrecarré lorsque le canal est coexprimé avec la CaM ainsi qu’un ralentissement de l’inactivation. Cette modulation pourrait être médiée par la fixation directe du calcium sur un motif EF du domaine C-terminal que nous avons mise en évidence. Des mutations du canal identifiées chez des patients épileptiques et localisées dans ce domaine C-terminal pourraient perturber la régulation du canal par ces deux effecteurs. La mutation W1801G abolit la liaison calcium-indépendante de la CaM et perturbe le repliement du domaine C-terminal. D’autres mutations augmentent la fixation de la CaM en présence de calcium et la diminuent en l’absence de calcium. Nous avons construit le canal Nav1. 1 étiqueté dans une boucle extracellulaire pour pouvoir détecter les cellules exprimant le canal et étudier d’éventuelles perturbations de son transport à la membrane. L’introduction d’une étiquette dans le premier domaine extracellulaire ne permet pas de détecter l’expression de surface du canal, mais donne des courants présentant les mêmes caractéristiques biophysiques que le canal non étiqueté. Le couplage N-terminal de la GFP au canal permet de visualiser les cellules transfectées. Le canal GFP-Nav1. 1 exprime des courants dans la lignée tsA201. L’introduction de la résistance à la Tetrodotoxine (TTX) par mutation ponctuelle conserve environ 80% du courant sodium après application de 5μM TTX. L’expression du canal GFP-Nav1. 1-TTXr sera testée dans différents types neuronaux en présence de TTX pour inhiber les conductances sodiques endogènes et plus particulièrement dans des neurones excitateurs et inhibiteurs afin de : 1) déterminer si la régulation de Nav1. 1 par la CaM et le calcium persiste et si elle varie suivant le type neuronal, 2) étudier l’impact des mutations sur le fonctionnement et les régulations du canal ainsi que sur l’excitabilité neuronale.
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Titre traduit
Differential regulation of the voltage gated sodium channel Nav. 1. 1 by calmodulin and calcium : a potentiel target of epileptogenic mutations
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