Expression, purification et caractérisation biophysique des RGPC de mammifères pour des études structurales

Expression, purification and biophysical characterisation of mammalian GPCRs for structural studies

• Auteur / Autrice : Kerstin Michalke
• Direction : Christian Cambillau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Sciences. Bioinformatique,
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 1
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Provence. Section sciences

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biomédicaments

Protéines G

Hormones -- Récepteurs

Résumé

G protein–coupled receptors represent the largest family of eukaryotic transmembrane signal transduction proteins. Because of their central role in the body, GPCRs are linked to many human diseases and are therefore important targets for therapeutics. The knowledge of high resolution x-ray structures for GPCRs would facilitate the development of those therapeutics. However, because of their hydrophobic nature and their low abundance in the body, only a few GPCR x-ray structures are known. Within the project MePNet, we therefore produced and characterised GPCRs to subject them to cristallisation assays. We have expressed 45 out of 100 GPCRs in inclusion bodies, almost the half of them with high yields. Expression is neither dependent on the expression temperature nor the cystein content nor the size of individual receptors. Gateway vectors appeared to be superiour to pET vectors and C43 proved to be the most successful expression strain. Expression was successfully scaled up in flasks and fermentors. Fermentor expressed huPTH1R and muCB1R were solubilised in SDS and refolded by artificial chaperone assisted refolding, yielding 280mg and 370mg of refolded PTH1R and CB1R per litre fermentor culture, respectively. Native receptor folding was verified by binding tests. For PTH1R/PTH(1-34) interaction a Kd of 6,5 nM was measured by BIAcore and 56 nM by tryptophan fluorescence quenching assay. CB1R showed an affinity of 38,2 nM for inverse agonist [3H]SR141716A and 19,4 nM for agonist [3H]CP 55,940 in the radioligand binding assay. The CB1R preparation contained 30% of active receptor. Analytic SEC coupled to LS/UV/RI detectors showed that the receptor preparations were contaminated with aggregates, which could be reduced by ultracentrifugation and ligand affinity chromatography, and by changing refolding and gelfiltration conditions. PTH1R and CB1R specific camel heavy chain antibodies fragments (vHHs) were generated and characterised by BIAcore. All tested fragments showed receptor binding activities in the nanomolar range (12- 70nM). Epitopes of PTH1R specific vHHs seem neither to overlap one another nor the binding site of ligand PTH (1-34), which might allow the usage of PTH1R/ PTH (1-34)/ vHH complexes with more than one vHH in crystallisation. PTH1R and CB1R were tested in up to 1400 crystallisation condition, none of these leading to the formation of crystals.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus large famille de récepteurs transmembranaires. En raison de leur rôle central dans la transduction des messages, les RCPG sont impliqués dans de nombreuses pathologies et représentent donc des cibles de la plus haute importance pour l’industrie pharmaceutique. La résolution de leur structure tridimensionnelle devrait faciliter le développement de nouvelles familles de médicaments. Cependant, en raison de leur nature hydrophobe et de leur faible abondance dans les tissus, seules 3 structures de ces RCPG ont pu être résolues. Dans le cadre du projet MePNet, nous avons donc entrepris de produire et de caractériser un certain nombre de ces récepteurs pour les soumettre à des essais de cristallogenèse. Nous avons exprimé sous forme de corps d’inclusion dans E. Coli 45 des 100 RCPG que contient notre collection. Presque la moitié d’entre eux ont été produits en grande quantité. Leur expression n’a pas été plus dépendante de la température d’induction que de leur composition en cystéine ou leur taille. Les vecteurs Gateway se sont révélés être bien plus efficaces que les vecteurs de la famille pET et la souche C43 a été la plus prometteuse. Les récepteurs ont ensuite été produits à l’échelle préparative en fioles et dans des bioréacteurs. Le récepteur de l’hormone parathyroïdienne PTH1R (huPTH1R) et le récepteur cannabinoïde (muCB1R) exprimés en fermenteur ont ensuite été solubilisés avec du SDS et renaturés à l’aide de cyclodextrine (« artificial chaperon assisted refolding »). 280 mg de PTH1R et 370 mg de CB1R ont ainsi été obtenus en partant d’un litre de culture. L’analyse par BIAcore et par spectroscopie de fluorescence des interactions entre le PTH1R et son ligand, le PTH(1-34), ont permis de trouver un Kd de 6,5 nM et 56 nM, respectivement. Des tests de fixation à l’équilibre entre le CB1R et deux de ses ligands marqués au tritium, l’agoniste [3H]CP55,940 et l’inverse agoniste [3H]SR141716A, ont révélé des affinités de 38,2 nM et 19,4 nM, respectivement. Au moins 30 % des récepteurs CB1R renaturés sont donc apparus comme étant pleinement fonctionnels. Des analyses par chromatographie d’exclusion couplée à une détection UV-visible, la spectroscopie infrarouge et la mesure dynamique de la lumière ont permis de montrer que ces récepteurs étaient contaminés par des agrégats. On pouvait réduire la quantité d’agrégats par ultracentrifugation et chromatographie d’affinité ou bien en modifiant les conditions de renaturation et de gel filtration. Des fragments d'anticorps à chaîne lourde (VHH) de camélidés spécifiques de ces deux récepteurs ont été synthétisés et caractérisés par BIAcore. Tous ces fragments ont présenté des affinités de l’ordre du nanomolaire (de 12 à 70 nM). Les épitopes des différents VHH générés pour le PTH1R, tous distincts les uns des autres, n’ont pas semblé se lier au site actif, ce qui nous a permis d’utiliser différents VHH pour des essais de co-cristallisation en présence également du peptide PTH(1-34). Ces essais, ~ 1400 conditions de cristallisation au total, sont restés jusqu’à présent infructueux.