Estudios sobre la topogénesis de los transportadores de purinas y de aminoácidos en aspergillus nidulans

par María Laura Harispe Francolino

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Ricardo Ehrlich et de Claudio Scazzocchio.

Soutenue en 2007

à Paris 11 en cotutelle avec [Montevideo], Universidad de la república , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Acides aminés
• Aspergillus nidulans
• Caséine

Résumé

Cette thèse porte sur l’identification et l’étude des facteurs qu’interviennent dans la régulation de l’expression post-transcriptionnelle des transporteurs d’acides aminés et de purines d’Aspergillus nidulans. Le travail est centré sur la caractérisation moléculaire et l’analyse du rôle physiologique de deux gènes censés être impliqués dans ces processus. Des études physiologiques faites au préalable sur des souches qui portent des allèles mutants du gène aauZ qui code une caseine kinase type I (CKI) ont mis en évidence que ces allèles empêchent la captation d’acides aminés à travers la membrane plasmatique et, en conséquence, ne permettent pas l’utilisation de ces composés comme source d’azote. La caractérisation génétique et moléculaire de ces allèles a révélé que les deux sont des mutations récessives qui portent des substitutions ponctuelles d’un seul acide aminé. Dans cette thèse la distribution sous-cellulaire du transporteur du L-aspartate et du L- glutamate (AgtA) est analysée dans un contexte génétique mutant, grâce à la construction de fusions géniques entre les séquences codantes de ce transporteur et celles de deux marqueurs différents, respectivement : la protéine fluorescente verte (GFP) et l’épitope HA. L’analyse par microscopie de fluorescence et par transfert Western de la distribution sous-cellulaire des protéines de fusion a montré que ces deux mutations dans aauZ empêchent l’expression de cette perméase dans la membrane plasmatique d’A. Nidulans et provoquent son adressage à la voie des corps multivésiculaires. L 'essai infructueux de générer une souche avec un allèle nul du gène aauZ a mis en évidence que ce gène est essentiel pour A. Nidulans, en démontrant que ce gène a chez A. Nidulans d’autres rôles additionnels à celui qui est étudié ici. Finalement, des données préliminaires issues de cette thèse, indiquent que l’ammonium a un effet régulateur négatif sur la demi-vie de ce transporteur, en provoquant on internalisation et dégradation dans la vacuole. Le deuxième sujet abordé dans cette thèse est l’identification moléculaire du gène affecté par la mutation gapA1, que l’on avait pensé être impliqué dans la régulation post-transcriptionnelle du transport de purines et d’acides aminés, et l’analyse de sa fonction. Le clonage de ce gène- par une stratégie de complémentation de fonction- a révélé qu’il s’agit d’un gène RasGap, un régulateur négatif de la ou les protéines Ras d’A. Nidulans, qui a été dénommé gapA. La construction d’une souche portant un allèle nul de ce gène (gapA∆) et la comparaison de son phénotype de croissance avec celui observé pour la souche gapA1, a permis de déterminer que cette dernière constitue une perte partielle de fonction de la protéine correspondante. Malgré les différentes approches expérimentales qui ont été essayées, il n’a pas été possible de déterminer si le gène gapA intervient dans l’expression ou dans l’activité des transporteurs. Cependant, dans cette thèse on approfondie l’analyse du rôle de gapA en ce qui concerne la croissance polarisée caractéristique de ces organismes. On démontre que, parmi d’autres phénotypes, la perte de fonction de gapA provoque des altérations dans l’établissement et la maintenance de la polarité cellulaire dans cet organisme : les conidies en germination de ces souches présentent un retard marqué dans l’établissement de la polarité cellulaire et des difficultés dans la maintenance de la croissance polarisée. D’ailleurs, les souches gapA∆ présentent un développement défectueux qui se manifeste par l’absence d’une couche d’ sterigmates dans le conidiophore et finalement, comme il a été constaté grâce à l’immunolocalisation, par une dépolarisation de la distribution du cytosquelette d’actine. L’expression d’une fusion traductionnelle de la protéine GapA avec la GFP a montré que GapA se trouve dans les extrémités apicales des hyphes et dans les septes. Cette localisation suggère que les protéines Ras, dont l’activité est négativement régulée par GapA, jouent un rôle dans la régulation du cytosquelette d’actine à l’extrémité de l’hyphe, et que cette régulation anormale est la responsable des phenotypes de polarité associés à la perte de fonction de GapA.

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