Etude par échange isotopique du radical tyrosyle en solution et dans la catalase bovine

Studies of the tyrosyl radical in solution and within the bovine catalase using isotopic labelling methodology

• Auteur / Autrice : Sophie Oppilliart
• Direction : Bernard Rousseau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hydroxyle

Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique

Catalase

Tyrosine

Mots clés libres

Marquage au tritium

Autoréparation

Résumé

Lors de la dégradation de H2O2 en eau et O2 catalysée par la catalase de foie de boeuf, il se forme un radical délocalisé sur ensuite sur un résidu tyrosyle de la chaîne polypeptidique. L’exacte localisation du résidu impliqué, donc le rôle de ce site d’oxydation alternatif, n’est pas connu. Par ailleurs, une méthode basée sur le marquage au tritium des résidus acides aminés a été mise au point au laboratoire. Elle est basée sur la génération de radicaux hydroxyle et leur réaction par arrachage d’un hydrogène de la chaîne latérale des acides aminés, génèrant ainsi un radical carboné. Un composé tritié le “répare” in situ, introduisant ainsi un marqueur stable. Nous avons donc utilisé les propriétés de réparation du vecteur tritié pour identifier quelle est la tyrosine impliquée dans les transferts d’électrons de la BLC. Même s’il a été montré par RPE que la disparition du radical porté par la tyrosine est effective en présence de l’agent de réparation, les études de marquage n’ont pas abouti à déterminer l’exacte localisation du radical. D’autres composés capables eux aussi de fournir un atome d’hydrogène par voie radicalaire ont été synthétisés puis testés sur ce système enzymatique par une étude de spectroscopie RPE. En parallèle, nous avons voulu comprendre les mécanismes d’action des ces mêmes composés sur un système modèle en générant des radicaux sur la tyrosine en solution par radiolyse de l’eau. Les radicaux ainsi générés peuvent être ensuite réparés par un atome de 2H fourni par un donneur. L’incorporation en 2H et la régiosélectivité de l’attaque sont ensuite analysées par SM et RMN 2H. Nous avons découvert un phénomène inconnu d’autoréparation et proposé un mécanisme.

During the dispropornation of hydrogen peroxide yielding water and oxygen by bovine catalase, one tyrosyl radical appears after few milliseconds, but the localization and the exact role of this radical remains obscure. In our laboratory, we have developed a methodology based on tritium labelling to characterize the sites of hydroxyl radical attacks on each amino acid. When HO• reacts with the amino acid side chain by H-abstraction, it forms a carbon-centered radical. We used tritiated phenyl phosphinic sodium salt as a 3H atom donor to scavenge the produced radical producing a irreversible label. We then used this labelled compound to understand the sites of the radical production within the catalase by adding the substance when the radical has already formed. Preliminary EPR results were rather encouraging as the radical seemed to be quenched by the added compound. When the labelling reaction was performed on the BLC, no specific labelling was detected. As the initial compound was inefficient in that case, we checked if others structures would be able to transfer one tritium atom to the tyrosyl radical. By monitoring the tyrosyl radical decrease by EPR spectroscopy. Some of them showed an improved reactivity than the initial compound. In parallel, we have decided to investigate the chemistry of tyrosyl radical in solution. Using a 2H-donor. The deuterium incorporation inside tyrosine was measured precisely by MS and the regioselectivity by 2H NMR. We shed light on a so far unknown process, i. E. The self repair of tyrosyle radical and proposed a mechanism.