Etudes des transferts de charges dans les centres réactionnels de la bactérie pourpre rhodobacter sphaeroides par spectroscopie de changement d'absorption et électrochimie

Absorption change spectroscopy and electrochemistry studies of the charge transfer in the reaction centers from the purple bacterium rhodobacter sphaeroides

• Auteur / Autrice : Hélène Cheap
• Direction : Pedro De Oliveira
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie. Chimie - Physique
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réactions de transfert de protons

Oxydoréduction

Centres réactionnels photosynthétiques

Mots clés libres

Energetique des quinones

Potentiel de réduction

Electrochimie

Résumé

Les centres réactionnels de la bactérie Rhodobacter sphaeroides sont des protéines redox de membrane qui convertissent l'énergie lumineuse en énergie libre chimique. L'absorption d'un photon déclenche une série de réactions de transfert d'électron couplées à des prises de protons entre les groupes prosthétiques et cofacteurs de la protéine. Un des principaux transferts d'électron implique deux quinones (QA et QB), un atome de fer (situé entre ces cofacteurs) et son environnement protéique. Nous avons montré par spectroscopie de changement résolue en temps l'influence de certains ligands du fer (M266H et M234E) sur la stabilisation énergétique du système des quinones. Le remplacement de l'histidine M266 par une leucine déstabilise le niveau d'énergie de QA- de 40 meV alors que celui du glutamate M234 par une histidine ou une leucine déstabilise les niveaux d'énergie de QA- et QB- de 70 meV. L'étude de variants portant des mutations dans l'environnement de QB (L213D et L218D) suggère que les transferts de protons vers QB impliquent un réseau étendu de liaisons hydrogène délocalisé sur la phase cytoplasmique de la protéine. Nos résultats supposent que les chemins de transfert de protons sont peu spécifiques sur le plan moléculaire. Enfin, dans le but de déterminer les potentiels redox des différents groupes prosthétiques et cofacteurs des centres réactionnels, ceux-ci ont été étudiés par voltamétrie cyclique. Les protéines ont été piégées dans un film de méthyle cellulose à la surface d'une électrode de graphite pyrolytique, méthode qui n'a jamais été tentée auparavant. Les potentiels de réduction de QA et QB ont été estimés à -0,156 et -0,079 V/ENH à pH 8 respectivement

The reaction centers from the Rhodobacter sphaeroides bacterium are redox membrane proteins that convert light energy into chemical free energy. Absorption of a photon triggers a series of electron transfer reactions coupled to proton uptake between the prosthetic groups and cofactors within the protein. One of the most important electron transfer reactions involves two quinones (QA and QB), one non-heme iron atom and the protein environment of this metal. We have shown by flash-induced absorbance change spectroscopy the influence of some of the iron ligands (M266H and M234E) on the energetic stabilisation of the quinone system. Indeed, the replacement of histidine M266 by a leucine destabilises the free energy level of QA- by about 40 meV, whereas the replacement of glutamic acid M234 by either a histidine or a leucine destabilises both the QA- and the QB- free energy levels by nearly 70 meV. The study of variants carrying mutations in the vicinity (5 Å, L213D) or further away (15 Å, L218D) from QB suggests that proton uptake and transfer to QB involve an extended hydrogen bond network delocalised over the cytoplasmic side of the protein. Our results support the hypothesis of the existence of non-specific proton delivery pathways at the molecular level. Finally, in order to determine the redox potential of the prosthetic groups and cofactors of the reaction centers, they were studied by cyclic voltammetry. The proteins were immobilized in a methyl cellulose film on the surface of a pyrolitic graphite electrode, a method which has never been tried before with this system. Reduction potential for QA and QB were estimated at −0,156 and −0,079 V/NHE at pH 8 respectively