Communication entre les plantes et leurs agents pathogènes : rôle des métabolites secondaires dans la reconnaissance du champignon Magnaporthe grisea par le riz
par Jérôme Collemare
Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Phytopathologie
Sous la direction de Marc-Henri Lebrun.
Soutenue en 2007
à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .
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Résumé
Magnaporthe grisea est le champignon ascomycète responsable de la principale maladie du riz, la pyriculariose. Les interactions entre M. Grisea et le riz sont contrôlées par des relations gène-pour-gène impliquant un gène d’avirulence dominant fongique et un gène de résistance dominant de la plante. Le gène d’avirulence ACE1 code une protéine fusion entre une polycétide synthase et une peptide synthétase non ribosomale (PKS-NRPS). Le signal d’avirulence reconnu par le produit du gène de résistance correspondant Pi33 serait le polycétide dont la biosynthèse dépend d’Ace1. La validation de ce nouveau modèle d’interaction gène-pour-gène requiert la caractérisation de ce métabolite secondaire. La région génomique où est localisé le gène ACE1 contient 15 gènes codant des protéines potentiellement impliquées dans une voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire. Outre ACE1, ce locus contient en particulier le gène SYN2, codant une autre PKS-NRPS, deux gènes RAP1 et RAP2 codant des énoyl réductases et le gène BC2 qui code un facteur de transcription putatif à doigt de zinc Zn(II)2Cys6. Les quinze gènes de ce locus présentent le même profil d’expression spécifique de la phase de pénétration du champignon dans les tissus végétaux, définissant ainsi un cluster de gènes. Le rôle de ces gènes dans l’avirulence de M. Grisea a été évalué par génétique inverse. Les mutants de délétion du gène SYN2 sont toujours avirulents sur les cultivars de riz possédant le gène de résistance Pi33. Les difficultés pour obtenir des mutants de délétion ou d’interruption pour les gènes RAP1 et RAP2 nous ont conduit à créer un mutant de délétion du gène KU80, impliqué dans la réparation des cassures double brin de l’ADN par jonction d’extrémités non homologues. La souche Guy11-Dku80 présente un fort taux de remplacement de gène qui varie entre 60 et 98% selon les loci, sauf au niveau du cluster ACE1. Ainsi, nous n’avons pu obtenir que deux mutants d’interruption pour le gène RAP2 qui sont toujours avirulents. La répression de l’expression des gènes RAP1, RAP2 et BC2 par interférence par ARN n’a pas conduit à l’obtention de transformants virulents. L’ensemble de ces résultats suggère que seul ACE1 est important pour la production du signal d’avirulence reconnus par la plante. Le gène ACE1 n’est exprimé que dans les appressoria de M. Grisea lors de l’initiation de la pénétration du champignon dans la plante hôte. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre afin d’identifier les réseaux de régulation et les signaux inducteurs impliqués dans l’expression appressoriale d’ACE1. Nous avons démontré que le facteur de transcription bZIP Bip1, impliqué dans la pathogénie de M. Grisea, est essentiel à l’expression appressoriale des gènes du cluster ACE1. Plusieurs motifs putatifs de fixation de facteurs de transcription ont été identifiés dans le promoteur d’ACE1 soit par délétion, soit par l’analyse de la fixation de Bip1. Le facteur de transcription Bc2 codé par un gène du cluster ACE1 pourrait également intervenir dans le contrôle de l’expression de ce cluster. Ainsi, la régulation de l’expression des gènes du cluster ACE1 est complexe et fait intervenir plusieurs facteurs de transcription. Malgré ces connaissances, nous n’avons pas pu trouver de conditions favorables à l’expression des gènes de ce cluster en culture mycélienne afin de produire en grande quantité le métabolite reconnu par les cultivars résistants de riz. Afin de produire ce métabolite, nous avons initié une stratégie d’expression constitutive du gène ACE1 chez M. Grisea. Cette stratégie nécessite une caractérisation du métabolome de la souche sauvage de M. Grisea Guy11. L’extraction des métabolites secondaires produits par le mycélium de Guy11 in vitro à permis d’identifier par LC/MS une vingtaine de métabolites putatifs dont la caractérisation a été commencée. Cette carte de référence permettra l’analyse rapide des métabolites secondaires produits par les transformants exprimant constitutivement ACE1 qui sont en cours de construction.
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Titre traduit
Plant-pathogen interactions : role of secondary metabolites in recognition of the blast fungus Magnaporthe grisea by rice
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Résumé
The Ascomycete Magnaporthe grisea is responsible for a dramatic disease on rice worldwide, called blast. Interactions between M. Grisea and rice involve fungal avirulence genes and corresponding plant resistance genes, defining gene-for-gene relationships. The avirulence gene ACE1 encodes for a hybrid polyketide synthase – non ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) involved in the biosynthesis of a polyketide thought to be the avirulence signal recognized by the rice Pi33 resistance gene. This new gene-for-gene model has to be validated by characterizing this secondary metabolite. The ACE1 locus is comprised of 15 genes that encode for putative secondary metabolism proteins. In addition to ACE1, this locus contains another PKS-NRPS encoding gene, SYN2, two enoyl reductases encoding genes RAP1 and RAP2, and the gene BC2, which encodes for a putative Zn(II)2Cys6 binuclear zinc finger transcription factor. All 15 genes display the same penetration specific expression pattern, defining a secondary metabolism gene cluster. Involvement of these genes in the avirulence of M. Grisea was assessed using reverse genetics strategies. ∆syn2 deletion mutants are still avirulent towards Pi33 resistant rice cultivars. Since obtaining RAP1 and RAP2 deletion or disruption mutants remained unsuccessful, we constructed the Guy11-Dku80 strain, in which the KU80 gene involved in non-homologous end joining was deleted. Gene replacement in this strain reaches 60 to 98% at all the targeted loci but the ACE1 locus. So only two ∆rap2 disrupted mutants were obtained, which are still avirulent. RNA interference to silence RAP1, RAP2 and BC2 genes did not result in virulent transformants. Altogether, these results suggest that only ACE1 is required for recognition by rice. ACE1 expression is connected to the initiation of the penetration of M. Grisea in the plant tissues. Several approaches were carried out to identify regulation networks and inducing signals involved in ACE1 appressorium specific expression. The bZIP-like transcription factor Bip1, involved in M. Grisea pathogenicity, was showed to be required for appressorium specific expression of the gene cluster ACE1. Deletion experiments and Bip1 binding assays identified putative transcription factors binding sites in the ACE1 promoter. The transcription factor Bc2, which is encoded by a gene located within the ACE1 cluster, could also be required for this appressorium specific expression. Thus, several transcription factors should be involved in the complex regulation of the ACE1 gene cluster expression. Our results did not reveal any permissive condition to the expression of this cluster in mycelia and subsequent large scale production of the metabolite recognized by rice resistant cultivars. Next, we initiated the constitutive expression of ACE1 in M. Grisea, which requires the characterization of the wild type strain Guy11 metabolome. Secondary metabolites produced in vitro by Guy11 mycelium were extracted and their LC/MS analysis identified about twenty putative secondary metabolites that are partially characterized. This reference map will facilitate the analysis of secondary metabolites produced by ACE1 constitutively expressing transformants, which are under construction.
