Caractérisation génétique de facteurs moléculaires de l'enveloppe bactérienne associés à la croissance immobilisée des bactéries

par Patrick Veiga

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Saulius Kulakauskas.

Soutenue en 2007

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Peptidoglycane
• Gram-positif
• Lactococcus lactis
• Streptococcus pneumoniae
• Lysozyme
• D-aspartate
• Exopolysaccharide

Résumé

Dans le cadre de l’étude des facteurs impliqués dans l’immobilisation des bactéries,nous nous sommes intéressés à deux polymères de la paroi, cruciaux pour la formation des biofilms : les exopolysaccharides (EPS) et le peptidoglycane (PG). Nous avons étudié le rôle des EPS de la capsule (CPS) dans la croissance immobilisée de Streptococcus pneumoniae en utilisant un milieu modèle semi-liquide. Nos résultats (i) montrent que des mutants CPS- s’échappent des colonies immobilisées, (ii) suggèrent un mécanisme de variation de phase impliquant le gène tts de la synthèse de la CPS et (iii) indiquent l’existence d’une pression de sélection contre l’immobilisation. Puisque l’intégrité du PG affecte la formation des biofilms, nous avons cherché de nouveaux facteurs moléculaires impliqués dans sa synthèse ou sa dégradation en utilisant la bactérie modèle Lactococcus lactis. L’un de ces facteurs est le gène aslA, responsable de l’incorporation du D-Aspartate dans le PG, que nous avons identifié grâce à une analyse soustractive de génome. L’inactivation conditionnelle de ce gène nous a permis de confirmer son rôle prédit et de montrer qu’il est essentiel. Nous avons également cherché les gènes permettant de réguler l’activité lytique des hydrolases du PG. Parmi eux, nous avons identifié les gènes codant pour une dé-N-acétylase (pgdA) et une O-acétylase (oatA) du PG ainsi qu’un régulateur de oatA : SpxB. Nos résultats nous ont permis de caractériser la cascade de régulations qui permet à la cellule, à partir d’un signal transduit par le système à deux composantes CesSR, de contrer l’hydrolyse de son PG en le modifiant par une O-acétylation accrue.

Titre traduit

Genetics of enveloppe cell factors linked with immobilized bacterial growth

Résumé

We studied two cell wall polymers implicated in biofilm formation: exopolysaccharide (EPS) and peptidoglycan (PG). Our investigation of capsule exopolysaccharides (CPS) of Streptococcus pneumoniae revealed that (i) CPS- mutants emerge from immobilized colonies in semi-liquid medium, (ii) a phase variation mecanism may be implied in appearance of mutations in tts gene, responsible for CPS synthesis, (iii) immobilisation is the factor providing a selective pressure. Since PG integrity affects biofilm formation, we looked for new molecular factors affecting PG synthesis or degradation. One of these factors, identified by subtractive genome analysis, is the gene aslA, responsible for D-Asp incorporation in the PG. Its conditional inactivation allowed us to confirm its function as D-Asp ligase and to show that it is indispensable. We also identified genes which could regulate lytic activity of PG hydrolysis and in thus affect PG integrity. We found three genes, overexpression if which leads to more resistant to hydrolysis PG: pgdA , oatA and spxB, encoding respectively for a PG de-acetylase, a PG O-acetylase, and the positive regulator of oatA. Our results allowed us to reveal the multi-step cascade of regulatory mechanisms, provoked by cell wall stress. It starts with induction of two component system CesSR in response to cell wall stress, and ends up with O-acetylation of PG by OatA as a mean of rendering it more resistant to hydrolytic damage. SpxB appeared to be a missing link between response to cell envelope stress and PG modification.