Analyse structurale d'endotoxines bactériennes par spectrométrie de masse

par Alina Tirsoaga

Thèse de doctorat en Chimie. Biochimie

Sous la direction de Martine Caroff et de Victor Sahini.

Soutenue en 2007

à Paris 11 en cotutelle avec l'Université de Bucarest , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Bactéries
• Lipopolysaccharides
• Lipide A

Résumé

Du point de vue chimique les endotoxines sont des lipopolysaccharides (LPS) constitués d’une chaîne de sucres, caractéristique de chaque espèce bactérienne, et d’une structure lipidique, le lipide A. Nous avons mis au point des méthodes d’analyse structurale et de purification permettant des avancées importantes dans le domaine de la relation structure-activité. La première est une micro-méthode d’analyse qui peut être appliquée à des quantités de bactéries de l’ordre du milligramme. Elle conduit à l’obtention de spectres de lipide A en une journée, au lieu d’une semaine par les techniques classiques. La seconde permet d’établir la structure et le positionnement des acides gras sur des quantités de lipide A minimes. Cette technologie a été appliquée aux lipides A de Citrobacter, une Entérobactérie responsable de maladies nosocomiales. Enfin, une méthode de purification permet d’obtenir des échantillons hautement purifiés pour les tests biologiques. Elle permettra des comparaisons plus fiables entre différentes préparations purifiées dans différents laboratoires. Nous avons aussi mis en évidence la présence de nouveaux substituants au niveau de la région lipidique des lipides A du genre Bordetella, dont B. Pertussis, la coqueluche. Il s’agit de la présence d’une glucosamine sur chaque phosphate dont l’implication sur les activités biologiques seront majeurs au niveau de l’action des peptides antibactériennes, car ces structures viennent neutraliser les charges du lipide A, la molécule responsable des activités endotoxiques du LPS.

Titre traduit

Structural analysis of bacteria's endotoxins using mass spectrometry

Résumé

Endotoxins are lipopolysaccharides (LPS) made up of a lipid - (called lipid A) and a sugar - chain, both characteristic of each bacterial species. We developed methods of structure analysis and a purification method representing an important improvement for studies of structure/activity relationships. The first one is a micro analytical method that can be applied to milligram quantities of bacteria. With it, one can obtain spectra of the lipid A in one day, instead of a week as for previous techniques. The second one leads to the determination of the structure and the positions of the fatty acids with a little amount of lipid A. This technology was applied to Citrobacter, an Enterobacterium causing nosocomial diseases. A LPS purification method gave highly purified samples suitable for biological tests. This method will give preparation having identical activities in different laboratories. We also have established the existence of new constituents on the lipid A of B. Bronchiseptica, from which the whooping cough originated. The presence of a glucosamine on the phosphate group(s) was demonstrated and its effect on the biological activities will be of high impact particularly on the activity of anti-bacterial peptides, as glucosamines neutralise the lipid A structure responsible for the endotoxic activities of LPS.