Etude des relations structure-fonctions du couple facteur Willebrand-ADAMTS13

par Julie Rayes

Thèse de doctorat en Biologie et pharmacologie de l'hémostase et des vaisseaux

Sous la direction de Dominique Meyer.

Soutenue en 2007

à Paris 7 .

mots clés

• Facteur de von Willebrand
• Purpura thrombotique thrombocytopénique
• Protéines recombinantes
• Protéines ADAM
• Mutagenèse dirigée
• Sites de fixation
• Animaux
• Humains

Résumé

Le facteur Willebrand (VWF) est une glycoprotéine multimérique indispensable à l'adhésion et l'agrégation plaquettaire. Son pouvoir hémostatique est proportionnel à son degré de multimérisation régulé in vivo par la protéase ADAMTS13. Un déficit en activité d'ADAMTS13 induit le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT). Un déficit en VWF induit la maladie de Willebrand (VWD). Notre travail est divisé en 2 parties : dans la première partie, l'étude de la sensibilité à ADAMTS13 des VWF de type 2A, 2B et 2M a été réalisée par la mesure des cinétiques d'hydrolyse de VWF recombinants mutés par I'ADAMTS13 recombinante. A basse force ionique, la sensibilité à ADAMTS13 est augmentée pour tous les mutants. La concentration physiologique de NaCI normalise la sensibilité des mutants de type 2M mais celle des VWFr de type 2A et 2B reste très augmentée indiquant que la perte des multimères de HPM dans la VWD type 2B est due, en grande partie, à une protéolyse augmentée par ADAMTS13. Les domaines d'interaction du VWF avec ADAMTS13 ont été identifiés en utilisant un panel de fragments de VWF recouvrant l'ensemble de la séquence de la protéine ainsi que des VWF recombinants sélectivement délétés. Il existe 2 sites de liaison sur le VWF : un site majeur sur le domaine A2 et un site primaire mais auxiliaire sur le domaine A3. La seconde partie de ce mémoire rapporte l'étude de 4 mutations d'ADAMTS13 identifiées chez des patients atteint de PTT héréditaire. Nous avons montré que le défaut en activité d'ADAMTS13 est: soit qualitatif, associé à une liaison diminué au VWF, soit quantitatif dû à une rétention cellulaire d'ADAMTS13.

Titre traduit

Relation structure-functions of the couple Von Willebrand factor-ADAMTS13

Résumé

Von Willebrand factor is a multimeric glycoprotein essential for platelet adhesion and aggregation. Multimerization degree is regulated in vivo par ADAMTS13. Deficiency in ADAMTS13 activity induces the thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Deficiency in VWF induces the Von Willebrand disease (VWD). The aim of this study is to establish the role of ADAMTS13 in the physiopathology of VWD type 2 and hereditary TTP and to specify VWF domains implicated in the recognition of ADAMTS13. Sensitivity of recombinant (r) VWF type 2 to proteolysis by rADAMTS13 was investigated. Using low ionic strength conditions, all mutations induced increased proteolysis of rVWF by ADAMTS13. At physiological salt concentration, type 2A and type 2B mutants exhibited a significantly higher susceptibility to ADAMTS13, whereas sensitivity of type 2M mutants to ADAMTS13 was normalized. In VWD type 2B, the spontaneous binding to platelets and excessive degradation by ADAMTS13 of VWF high-molecular-weight multimers may account for their clearance from plasma. Using a panel of VWF-fragments overlapping the entire VWF subunit and deleted-VWF, two distinct regions in von Willebrand factor contribute to binding of ADAMTS13: A major binding site within the A2 domain and a primary but auxiliary binding site within the A3 domain. The second part of this thesis report the study of 4 mutations of ADAMTS13 identified in hereditary TPP patients. We established that these mutations were responsible for the disease. The defect of ADAMTS13 activity is even qualitative, associated with reduced binding to VWF, even quantitative,resulting of intracellular retention.