Viabilité et fonctionnalité des cellles souches mésenchymateuses humaines dans un environnement ischémique

par Esther Potier

Thèse de doctorat en Biologie de l'os, des articulations et biomatériaux des tissus calcifiés

Sous la direction de Laurent Sedel.

Soutenue en 2007

à Paris 7 .

mots clés

• Cellules souches mésenchymateuses
• Hypoxie cellulaire
• Incontinentia pigmenti
• Protéines angiogéniques
• Cellules stromales

Résumé

L'application locale de cellules réparatrices, comme les cellules souches du mésenchyme (CSMs), constitue une approche prometteuse pour la réparation de nombreux tissus, mais dont le succès repose sur le maintien de cellules viables et fonctionnelles après transplantation. Or lorsqu'elles sont implantées, les CSMs se retrouvent dans un environnement avasculaire caractérisé par une hypoxie et une carence en nutriments pouvant affecter la viabilité et la fonctionnalité des CSMs. Une hypoxie temporaire (≤1% O²; 48h), au contraire d'une carence en sérum (1% FBS), n'a pas d'effet sur la viabilité cellulaire. Prolongée (120h) et associée à une carence en sérum, elle provoque la mort de la quasi-totalité des CSMs (99%). L'hypoxie temporaire, cependant, affecte durablement, jusqu'à 28 jours après l'exposition, la fonctionnalité des CSMs en inhibant l'expression de plusieurs marqueurs ostéoblastiques (Runx2, ostéocalcine et collagène de type I), mais ne stimule que faiblement le potentiel angiogène des CSMs (des quatre facteurs testés seul le VEGF est stimulé). La stimulation de l'expression de facteurs angiogènes par les CSMs pourrait permettre, en accélérant la revascularisation, de maintenir un nombre plus important de cellules viables et fonctionnelles. Pour cela, les CSMs ont été traitées à la desferrioxamine (DFX), un inducteur chimique du facteur de transcription HIF1 régulant l'expression de plusieurs facteurs angiogènes. Sous normoxie (21% O²) la DFX augmente l'expression du VEGF et du bFGF, la stimulation (50%) du VEGF étant maintenue sous hypoxie. Des CSMs traitées à la DFX pourraient donc être utilisées pour accélérer l'envahissement vasculaire des sites d'implantation.

Titre traduit

VlABILlTY AND FUNCTIONNALITY OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS IN AN ISCHEMIC ENVIRONMENT

Résumé

Local supply of mesenchymal stem cells (MSCs) has been proposed for the repair of damaged tissues. However, upon transplantation, MSCs are far from the vasculature and experience nutrient and oxygen starvation, which may affect cell viability and functionality. The first part of this thesis aimed to assess in vitro the effects of serum and oxygen deprivation on the human MSC survival rates. The MSC death rates were not affected by a 48h hypoxia (≤1% O2), but were increased (13%) by FBS starvation (1% FBS). Most importantly, long-term (120h) hypoxia combined with serum deprivation resulted in the complete death of MSCs (99%). The effects of a 48h hypoxia on MSC functionality were then investigated. When leading to limited stimulation of angiogenic factor secretion (from all the angiogenic factors tested only VEGF was increased 2-fold), hypoxia results in persistent down-regulation of MSC bone forming potential (persistent down-regulation of Runx2, osteocalcin and type I collagen expression). The last part of this thesis described a method to enhance the MSC angiogenic factor expression in order to accelerate vascularization. For this purpose, MSCs were treated with DFX, a chemical inducer of HIF-1, a transcription factor involved in the expression of several angiogenic factors. Under normoxia, DFX exposure resulted in up-regulation of bFGF (20-fold) and VEGF (4-fold) expression. Under hypoxia, DFX induced a 50% increase in VEGF secretion. These results suggest that DFX-exposed MSCs could be used to supply angiogenic factors to promote the establishment of a vascular network providing nutrients and oxygen to the transplanted cells.