Etude mécanistique et fonctionnelle de la réponse du mélanome au traitement par chloroéthylnitrosourée, seul ou associé à une carence en méthionine
par Samuel Guénin
Thèse de doctorat en Oncologie
Sous la direction de Aïcha Demidem.
Soutenue en 2007
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Résumé
La méthionine (Met) est un acide aminé essentiel impliqué dans plusieurs voies métaboliques telles que la synthèse des protéines, polyamines, acides aminés soufrés (taurine et glutathion) et la méthylation de nombreuses espèces (créatine, phosphatidylcholine, ADN, protéines) par l'intermédiaire de sa forme active : la S-adénosylméthionine (SAM). Les cellules tumorales sont caractérisées par des altérations du métabolisme de la Met et témoignent d'une dépendance plus ou moins marquée à cet acide aminé. Certaines chimiothérapies ciblent le métabolisme de la Met dont les chloroéthylnitrosourées (CENU) qui, en plus de leur effet génotoxique, induisent une hypométhylation de l'ADN et ciblent le métabolisme de la Met. C'est la raison pour laquelle l'utilisation de régimes nutritionnels carencés en Met, seuls ou associés à des chimiothérapies, a ét étudiée pour améliorer l'efficacité du traitement de certains types de cancers (prostate, gliome, mélanome). Quelques travaux renseignent, au niveau transcriptionnel, sur l'effet de la carence en Met dans les tumeurs. Cependant, la réponse métabolique des tumeurs à une carence en Met seule ou associée à une chimiothérapie, et les voies de signalisation impliquées dans cette réponse sont mal connues. L'objectif de ce travail a été de définir les phénotypes métaboliques de dépendance et d'indépendance à la Met dans les tumeurs de mélanome B16 murin soumises à une carence nutritionnelle en Met, in vivo en modèle syngénique et in vitro en modèle de culture cellulaire. Nos travaux ont montré que la dépendance à la Met des cellules tumorales est caractérisée par une méthylation préférentielle des récepteurs de méthyles cytoplasmiques (créatine, phosphatidylcholine) et que l'indépendance à la Met est en revanche caractérisée par la méthylation préférentielle de macromolécules (ADN et protéines). Nous avons ensuite déterminé la réponse du métabolisme tumoral du mélanome B16 in vivo à un stress nutritionnel en Met, associé ou non à un traitement par CENU. Nos résultats démontrent que la carence en Met seule a des effets ubiquitaires partiellement réversibles après retour à une alimentation normale. L'association de la carence en Met au traitement par CENU potentialise l'inhibition de prolifération tumorale induite par la chimiothérapie. Ces travaux nous ont permis d'établir que la synergie thérapeutique observée à long terme est reliée à des désordres des métabolismes tumoraux énergétique (inhibition de la glutaminolyse) et phospholipidique (augmentation de la synthèse par méthylation de la phosphatidylcholine et de son hydrolyse). Ces travaux sont validés par des résultats obtenus in vitro en culture de cellules de mélanome B16. Sur la base des données concernant les effets du traitement par CENU et sur la réparttion des méthyles, nous avons analysé l'effet du traitement par CENU sur la méthylation dépendante de la SAM et l'activation de la protéine phosphatase 2A (PP2A). PP2A est impliquée dans la régulation de l'activation de Akt et de la stabilité de c-Myc et est également proposée comme un suppresseur de tumeur. Nos résultats montrent que le traitement par CENU induit l'augmentation de la méthylation et de l'activité de PP2A, ayant pour conséquence l'inactivation d'Akt et la dégradation de c-Myc. Ces résultats sont les 1ers à suggérer une intercation entre PP2A et PTEN, protéine suppresseur de tumeur fréquemment muté dans le mélanome. En conclusion, la présente thèse ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes métaboliques de la réponse à un stress nutritionnel, associé ou non à une chimiothérapie conventionnelle. Le rôle majeur des transméthylations dépendantes de la SAM dans la réponse au traitement par CENU a été démontré par l'analyse de la méthylation de PP2A. Des études futures viseront notamment à relier, par l'intermédiaire du métabolisme des acides gras et de la voie des pentoses phosphates, la régulation des métabolismes phospholipidique et énergétique à la régulation de la méthylation de PP2A. Ces données permettront d'aborder les mécanismes reliant la méthylation de PP2A et la carcinogenèse et participeront à la mise au point de thérapies ciblées efficaces.
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Résumé
Methionine (Met) is an essential amino acid involved in several metabolic pathways such as protein synthesis, polyamines, sulfur amino acids (taurine and glutathione) production and transmethylation of many compounds (creatine and phosphatidylcholine synthesis, DNA, protein) through its active form : S-adenosylmethionine (SAM). Tumor Met metabolism is frequently altered and tumors are more or less dependent to this amino acid. Several anticancer treatments, such as chloroethylnitrosoureas (CENUs), besides their genotoxic effect, target Met metabolism and induce DNA hypomethylation. This is why the use of Met depleted regimen, alone or associated with chemotherapy, was studied to improve the efficiency of somme cancer treatments (prostate, glioma, melanoma). Few studies showed the effect of Met deprivation stress (MDS) in tumors at the transcriptional level. However, the metabolic response of tumors to MDS, alone or associated with chemotherapy, and signalling pathways involved in this response remain poorly known. The goals of our work were to define the metabolic phenotypes of Met dependence and independence in murine B16 melanoma tumors subjected to MDS, in vivo (syngeneic model) and in vitro (cultured cells). We showed that tumor Met dependency was characterized by preferential methylation of cytoplasmic methyl acceptors (creatine and phosphatidylcholine synthesis) and that Met independency was characterized by preferential methylation of macromolecules (DNA and proteins). Then we determined the response of B16 melanoma tumor metabolism to MDS in vivo, alone or in association with CENU treatment. Our results showed that Met deficiency lead to ubiquitous effects which were partially reversible, after return to a normal diet. Moreover association of Met deprivation to CENU treatment potentiated tumor growth inhibition induced by chemotherapy alone. This work enabled us to establish that the therapeutic synergistic effect observed was related to defects of the energetic (reduction of glutaminolysis) and phospholipid (increase of phosphatidylcholine synthesis by methylation and hydrolysis) metabolism. These results were confirmed by in vitro analyses in cultured B16 melanoma cells. On the basis of data related to the effects of CENU treatment on methyl groups distribution, we analysed the effect of CENU treatment on SAM dependent methylation and on protein phosphatase 2A (PP2A) activation. PP2A is involved in the regulation of Akt activation and in c-Myc stability and is also proposed as a tumor suppressor. PP2A shares its regulating role of Akt pathway with another tumor suppressor frequently mutated in melanoma, PTEN. Our results showed that CENU treatment induced an increase of PP2A methylation and activity. This led to Akt inactivation, c-Myc degradation and PTEN activation. Our results were the first to describe an interaction between PP2A and PTEN. In conclusion, the present doctoral thesis gave new prospects in the understanding of metabolic mechanisms involved in tumor response to a nutritional stress, alone or in association with conventional anticancer chemotherapy. The major role of SAM dependent transmethylations in the response to CENU treatment was highlighted by the analysis of PP2A methylation. The future prospects will particularly aim at connecting, the metabolic response of tumor cells to PP2A activation, especially threw phospholipid and energetic (glycolysis and pentose phosphate pathway) metabolism. These data give new informations linking PP2A methylation anticancer therapy, and give substantial informations for the development of effective targeted therapies.
