Identification du gène TT10 codant une laccase : caractérisation de sa fonction dans l'oxydation des flavonoïdes de la graine chez Arabidopsis thaliana

par Lucille Pourcel

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Loïc Lepiniec.

Soutenue en 2006

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Proanthocyanidines
• Flavonols
• Brunissement
• Oxydation

Résumé

Deux classes de flavonoïdes sont présents dans les graines d’Arabidopsis thaliana : les procyanidines (PAs) ou tannins condensés résultant de la condensation de sous-unités flavane-3-ols (épicatéchines) et les flavonols. Ces composés phénoliques jouent un rôle important dans la qualité des semences et en santé humaine, en particulier de par leurs propriétés antioxydantes et antimicrobiennes. Bien que les étapes de la biosynthèse des flavonoïdes soient bien caractérisées, les mécanismes de polymérisation, oxydation et compartimentation des PAs restent inconnues. Chez Arabidopsis, le brunissement des téguments de la graine résulte de l’oxydation des flavonoïdes au cours de la maturation. Ce brunissement est retardé chez le mutant tt10, par comparaison avec les graines de type sauvage. Des expériences réalisées in vivo ont montré que TT10 pouvait intervenir dans le brunissement des téguments en présence d’épicatéchine exogène. Les produits d’oxydation obtenus correspondent à des dimères jaunes appelés déhydrodiépicatéchine A, qui diffèrent des PAs par leur liaisons interflavaniques. Les graines tt10 accumulent également plus de monomères de quercétine-rhamnoside et moins de dimères de flavonols que celles du type sauvage. Le gène TT10 a été identifié par une approche gène-candidat. Il code une polyphénol oxydase de type laccase. TT10 est essentiellement exprimé dans les graines en développement. L’activité du promoteur, l’ARNm et la protéine sont détectés dans les téguments, où ils colocalisent avec les cellules accumulatrices de PAs et de flavonols. L’ensemble de ces résultats met en évidence une activité de la laccase TT10 dans l’oxydation des flavonoïdes. Des études ultérieures concernant la régulation spatio-temporelle de l’expression du gène, ainsi que la localisation subcellulaire de la protéine et son activité in vitro seront nécessaires pour comprendre les mécanismes d’interaction entre les flavonoïdes et TT10, ainsi que le rôle physiologique de l’enzyme dans la graine.

Titre traduit

Characterization of the TRANSPARENT TESTA 10 gene encoding a laccase-like protein involved in flavonoid oxidation in Arabidopsis seed coat

Résumé

The two major end-products of the flavonoid pathway present in Arabidopsis seeds are procyanidins (PAs; syn. Condensed tannins) and flavonols. These polyphenolic compounds have an important impact on agronomic and nutritional qualities of seeds. Whereas most biochemical steps of the flavonoid pathway are characterised, the mechanisms of PA polymerisation, oxidative browning and compartmentation remain to be elucidated. In Arabidopsis, seed coat browning is caused by the oxidation of PAs, which are polymers of flavan-3-ols subunits such as epicatechin. The tt10 mutant exhibits a delay in developmentally-determined browning of the seed coat. The tt10 seeds accumulate more soluble PAs than wild-type seeds. Moreover, in vivo studies using the mutant suggest that in seed-coat cells, TT10 is involved in browning activity in the presence of epicatechin, and that the major oxidation products are yellow dimers called dehydrodiepicatechin A. These products differ from PAs in the nature and position of their interflavan linkages. Flavonol composition was also affected in tt10 seeds, which exhibited a higher ratio of quercetin-rhamnoside monomers vs. Dimers, compared to the wild type. We identified the TT10 gene by a candidate-gene approach. TT10 encodes a protein with strong similarity to laccase-like polyphenol oxidases. We showed that TT10 is essentially expressed in developing seeds. TT10 promoter activity, mRNA and protein were detected in developing testa, where they co-localize with PAs and flavonols. Together, these data establish that the TT10 laccase-like protein is involved in flavonoid oxidation. Further investigations of the TT10 gene spatio-temporal regulation as well as protein subcellular localization and enzymatic activity will be necessary to understand how it interacts with the flavonoids substrates, and thus what is its physiological role in seeds.