Characterisation of recombination functions of the orf12-15 DNA region from the bIL67 bacteriophage active against Lactococcus lactis subsp. Lactis

par Agnieszka Katarzyna Szczepańska

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Marie-Christine Chopin et de Jacek Bardowski.

Soutenue en 2006

à Paris 11 en cotutelle avec Warsaw, Polish academy of sciences , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

Titre traduit

Caractérisation des fonctions de recombination des orfs12-15 du phage bIL67 actif sur Lactococcus lactis subsp. Lactis

Résumé

La recombinaison homologue est essentielle au maintien de la stabilité du génome et à son évolution. Les phages possèdent des mécanismes de recombinaison particuliers qui participent efficacement à leur multiplication et à leur évolution en favorisant la circularisation et la réplication de leur ADN ainsi que les échanges horizontaux de gènes. Les études menées sur le phage bIL67 virulent pour Lactococcus lactis subsp. Lactis avaient montré que la protéine codée par l’orf13 est homologue à la recombinase Erf du phage P22. Sur la base de données de génomique comparative des phages, nous avons identifié un module putatif de recombinaison qui comprend les orfs 12 à 15. Notre travail a ensuite montré que le phage bIL67 est capable d’effectuer sa propre recombinaison homologue en l’absence de la protéine bacterienne RecA. Nous avons aussi montré que ce phage inhibe l’activité exonucléase et celle de recombinaison du complexe RexAB chez L. Lactis. La caractérisation biochimique de la protéine codée par l’orf14 a montré que c’est une protéine de type SSB. Par des expériences de retard de migration en gel il a été démontré que Orf14 est capable de se lier d’une manière séquence non spécifique aux acides nucléiques simple brin. La modélisation de la structure tridimensionnelle de la protéine, combinée à une analyse in vitro de protéines mutantes purifiées, indique que le domaine de liaison à l’ADN de la protéine se situe dans un domaine OB putatif (oligosaccharide/oligonucleotide binding), une caractéristique partagée par toutes les protéines SSB. De plus, Orf14 est capable de complémenter partiellement in vivo le défaut de croissance d’un mutant ssb thermosensible d’E. Coli.

Résumé

Recombination is involved in key stages of phage multiplication. Due to its importance for phage development, it is postulated that phages do not rely only on host-encoded functions but posses their own recombination proteins. Despite general indications that lactococcal phages can recombine, existence of recombination systems lacked direct proof. Results of this thesis supply evidence of phage bIL67-mediated recombination and studies that led to characterising individual recombination genes in the phage genome. This work presents in a general way that phage bIL67 encodes proteins proficient in promoting recombination. Phage bIL67 was shown to develop and recombine independently of host RecA protein, which suggested the presence of phage-encoded proteins promoting the same events as bacterial recombination proteins. The putative recombination region was defined to orfs12-15 of the early transcribed part of the phage genome. Finding orf13 gene product to be homologous to phage P22 Erf recombinase and an overall organisation similarity with P22 recombination module were the initial evidences suggesting localisation of the putative recombination gene cluster in this region. Identification of orf14-encoded SSB function just upstream of orf13 supplied further proof. Putative recombination region was shown to encode anti-Exo activity acting against main lactococcal Exo protein (RexAB). Molecular characterisation of Orf14 activity in vitro confirmed its affinity for single-stranded nucleic acids. Amino acid substitution of Orf14 led to identification of the functional domains involved in DNA binding and protein-protein interactions. In vivo complementation studies proved Orf14 to partially substitute SSB of E. Coli.