Caractérisation de facteurs impliqués dans l'épissage alternatif du pré-ARNm de la bêta-tropomyosine au cours de la différenciation myogénique

par Jérôme Saulière

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Joëlle Marie.

Soutenue en 2006

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Biologie moléculaire et cellulaire
• Spliceosome

Résumé

L’épissage alternatif favorise la sélection de différentes combinaisons d’exons au sein d’un pré-ARNm permettant la synthèse de plusieurs ARNm matures générant ainsi des protéines isoformes avec des fonctions distinctes voire antagonistes. Chez les eucaryotes supérieurs, ce processus nucléaire de maturation des pré-ARNm est essentiel pour générer la diversité du protéome cellulaire. La thématique du laboratoire est l’analyse des mécanismes moléculaires qui régulent l’épissage alternatif des pré-ARNm chez les métazoaires. Notre modèle d’étude est le pré-ARNm de la b-tropomyosine aviaire. Ce dernier possède dans sa région centrale deux exons mutuellement exclusifs selon le type cellulaire. L’exon 6A est inclus dans les ARNm des cellules non-musculaires et des cellules de muscles lisses tandis que l’exon 6B est incorporé dans les cellules de muscles squelettiques. Les objectifs du laboratoire sont de caractériser de manière exhaustive les éléments cis et trans-régulateurs impliqués dans le contrôle de l’épissage alternatif de ces deux exons au cours de la différenciation myogénique. Les travaux antérieurs du laboratoire (et d’autres équipes) suggéraient un rôle répresseur de la région intronique en amont de l’exon 6B sur l’épissage de cet exon. Toutefois, les facteurs protéiques impliqués dans le contrôle de la sélection de l’exon 6B via cette séquence étaient jusqu’à présent inconnus. L’identification de ces facteurs a fait l’objet de mon travail de thèse. Dans ce but, j’ai purifié les complexes protéiques associés à la région régulatrice en amont de l’exon 6B par la technique de chromatographie d’affinité en utilisant l’ARN comme appât. Les protéines ont été séparées par électrophorèse bi-dimensionnelle et identifiées par spectrométrie de masse et western-blot. Nos résultats ont permis de caractériser deux nouveaux facteurs impliqués dans le contrôle de l’épissage alternatif de l’exon 6B. La protéine PTB réprime l’épissage de cet exon en inhibant les étapes précoces de l’assemblage du spliceosome. Nos résultats montrent que PTB interfère avec l’interaction du facteur d’épissage U2AF65 sur la région riche en pyrimidine et empêche l’association de la snRNP U2 sur le point de branchement de l’exon 6B. A l’inverse, les protéines de la famille CELF activent la sélection de l’exon 6B. Nos résultats montrent un antagonisme entre les protéines PTB et CELF sur la sélection de l’exon 6B. Par ailleurs, nos travaux ont permis d’identifier plusieurs autres facteurs dont la fonction dans la régulation de l’épissage alternatif de l’exon 6B reste à démontrer. Ces protéines, nommées nucléoline, p54nrb et TLS possèdent des caractéristiques intéressantes. En effet, ces facteurs font partie des protéines dites de couplage entre les processus de transcription et d’épissage et pourraient donc être impliquées dans le contrôle de l’épissage alternatif de l’exon 6B lors de la différenciation myogénique.

Titre traduit

Characterization of factors involved in alternative splicing of the beta-tropomyosin pre-mRNA during myogenic differenciation

Résumé

Alternative splicing generates several mRNAs from a single gene, leading to the synthesis of several proteins with distinct biological functions. In higher eucaryotes, this nuclear process is particularly prominent and generates the protein diversity of the cell. We are using the chicken beta-tropomyosin pre-mRNA to investigate the regulation of alternative splicing. This pre-mRNA contains two mutually exclusive exons that are recognized differently according to myogenic differentiation. Exon 6A is present in mRNA from nonmuscle cells and myoblasts while exon 6B is present in skeletal muscle and myotubes. The aim of the laboratory is to determine all the cis and trans regulatory elements involved in the selection of these two exons during myogenic differentiation. We and others have shown that mutations dispersed along the intron upstream of the exon 6B activate splicing of this exon suggesting that it contains several regulatory motifs involved in the repression. My thesis project was to characterize the factors involved in the repression of the splicing of this exon via this sequence. To identify factors that regulate splicing of exon 6B, I have used a RNA affinity chromatography strategy to isolate protein complexes. Proteins were separated by 2D gels and identified by mass spectrometry and western-blot analysis. Our results show that PTB represses the splicing of exon 6B in vitro and ex vivo. PTB interferes with the association of U2 snRNP on the branchpoint and competes with the binding of U2AF65 on the pyrimidine tract upstream of exon 6B. The CELF proteins activates the splicing of this exon by antagonizing the repressor effect of PTB. We have also characterized others proteins which are able to bind the same regulatory element called nucleolin, p54nrb and TLS. These proteins are Transcription/Splicing factors which might be involved in the regulation of alternative splicing of exon 6B.