Développement d'un système de génétique inverse pour le virus de la fièvre de la vallée du Rift et analyse du rôle des régions non codantes du génome

par Nicolas Gauliard

Thèse de doctorat en Génomes et protéines

Sous la direction de Michèle Bouloy.

Soutenue en 2006

à Paris 7 .

mots clés

• Virus de la fièvre de la vallée du Rift
• Transcription génétique
• ARN viral
• Régulation de l'expression des gènes viraux
• Génome viral

Résumé

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (VFVR) est un arbovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae, genre Phlebovirus. Présent en Afrique, il est transmis par les moustiques et infecte l'homme et les ruminants. Le génome viral est composé de trois segments d'ARN simple brin de polarité négative: le segmente L code pour une ARN polymérase ARN dépendante, M pour le précurseur des glycoprotéines d'enveloppe et S pour la nucléoprotéine N et la protéine non structurale NSs. Un système de génétique inverse pour le VFVR a été établi en utilisant des protéines produites par des virus de la vaccine recombinants (Lopez et al. 1995). Ce model a démontré que les protéines L et N sont nécessaires et suffisantes pour transcrire un minigénome mimant un ARN S viral contenant le gène rapporteur CAT en orientation antisens flanqué des séquences non codantes du segment S mais l'efficacité de transcription était faible. Nous avons développé un système de minigénome complet basé sur la transfection de plasmides. Les protéines virales sont exprimées par l'ARN polymérase T7. Les minigénomes LCAT, MCAT et SCAT mimant les trois segments viraux L, M et S sont synthétisés par des plasmides sous le contrôle de l'ARN polymérase I cellulaire. Dans ces conditions, les minigénomes sont transcrits et répliqués. La terminaison de la transcription des ARNm est également similaire à celles des ARNm viraux. L'efficacité de transcription du minigénome L est supérieure à celle de S et de M. Nous avons mis en évidence que la force de transcription des promoteurs déterminée avec les minigénomes joue un rôle important dans la régulation du taux de synthèse des ARN viraux dans les cellules infectées.

Titre traduit

Development of a reverse genetics system for Rift Valley fever virus and analysis of the role of the non coding regions of the genome

Résumé

The Rift Valley fever virus (RVFV) is a phlebovirus of the"BunyaviridaëJarnlly present in Africa and transmitted by mosquitoes and affecting cattle and humans. The viral genome is composed of three segments of RNA of negative polarity: the L segment codes for a RNA polymerase RNA dependent, the M segment for the glycoproteins precursor and the S segment for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. A reverse genetics System for the RVFV was developped using recombinant vaccinia viruses expressing viral proteins (Lopez et al. 1995). This model showed the N and L proteins are necessary and sufficient to transcribe a minigenome mimicking a viral S segment containing the CAT reporter gene in the non coding orientation and flanked by the non coding regions of the S segment. We developed a complete minigenome System for the RVFV based on transfection of plasmids. Viral proteins are expressed under T7 polymerase control. LCAT, MCAT and SCAT minigenomes, mimicking the three viral segments L, M and S, are synthetized with plasmids under the cellular RNA polymerase I control and are transcribed and replicated. The termination of mRNA transcription was also similar to viral one. Transcription efficiency of the LCAT minigenome was stronger than the S one and the M one. We showed that promoters strength determined with this System play an important role in levels of viral RNAs produced during cellular infection.