La phosphoprotéine rabique et ses partenaires viraux et cellulaires : rôle dans l'échappement viral à l'immunité innée et fonction des corps de Negri

par Aurore Vidy

Thèse de doctorat en Microbiologie et virologie

Sous la direction de Danielle Blondel-Maingonnat.

Soutenue en 2006

à Paris 7 .

mots clés

• Virus de la rage
• Interférons
• Corps d'inclusion viraux
• Phosphoprotéines
• Protéines de liaison à l'ADN
• Facteur de transcription STAT-1
• Transduction du signal

Résumé

La phosphoprotéine P du virus de la Rage est une protéine multifonctionnelle qui sert de cofacteur pour la polymérase virale L et de chaperon pour la nucléoprotéine N, et qui est également à l'origine, avec la N, de la formation d'inclusions cytoplasmiques spécifiques de l'infection rabique : les corps de Negri. La P interagit également avec des protéines cellulaires comme PML (Promyelocytic Leukaemia) et STAT1 (Signal Transducer and Activator of Transcription), toutes deux impliquées dans la réponse aux interférons. La caractérisation de l'interaction de P avec STAT1, initialement identifiée par un crible double-hybride, a montré que la partie carboxyterminale de P interagit avec la région de STAT1 comprenant le coiled-coil et le domaine de liaison à l'ADN. Cette interaction a ensuite été confirmée par expérience de pull down. L'étude de la fonction de cette interaction a démontré que celle-ci est capable d'inhiber les réponses cellulaires aux interférons de type I et II, médiées par STAT1, afin de contrecarrer les effets antiviraux de ces interférons. Nous avons recherché les mécanismes de cette inhibition, et nous avons pu montrer que la P rabique, en général cytoplasmique, était capable d'inhiber l'accumulation nucléaire de STAT1 en réponse aux interférons, mais que cette inhibition n'était pas absolument indispensable pour inhiber la réponse aux interférons puisque les formes nucléaires de P, en particulier son sous-produit P3, étaient également capables d'inhiber cette réponse sans avoir d'effet sur l'accumulation nucléaire de STAT1. Des études plus poussées ont montré que P et P3 sont tous deux capables d'inhiber la liaison de STAT1 à l'ADN, ce qui explique ce phénomène. La protéine P pourrait donc utiliser deux mécanismes pour inhiber plus efficacement la réponse cellulaire aux interférons. La fonction des corps de Negri, dont les protéines P et N sont les composants majeurs, était jusqu'à présent inconnue, c'est pourquoi nous avons réalisé une analyse protéomique afin d'identifier d'autres protéines qui pourraient y être associées. Parmi elles se trouvent beaucoup de protéines impliquées dans la traduction, qui nous ont orientés vers l'hypothèse que les corps de Negri seraient des usines virales. Un autre partenaire de ces corps, qui a été confirmé, est la protéine de choc thermique HSP70. Nous avons montré que l'expression de celle-ci est induite lors de l'infection rabique, et qu'elle y jouerait un rôle proviral. Cependant, les mécanismes de son action provirale ne sont pour l'instant pas connus, ni leur lien avec sa localisation au niveau des corps de Negri.

Titre traduit

Rabies phosphoprotein and its viral and cellular partners : function in viral escape to innate immunity and function of Negri bodies

Résumé

Rabies virus phosphoprotein P is a multifunctional protein. P is the cofactor of rabies polymerase L and also acts as a chaperon protein for the nucleoprotein N. P and N together induce cytoplasmic inclusion bodies formation. These structures are named Negri bodies and are specific of Rabies infection. Moreover P interacts also with cellular partners: PML (Promyelocytic Leukaemia) protein and STAT1 (Signal Transducer and Activator of Transcription), that are both implicated in IFN response. We have characterized the interaction between P and STAT1, and the results have shown that C-terminal part of P interacts with the coiled-coil and the DNA binding domain of STAT1. Then this interaction has been confïrmed by pull down experiments. By studying the function of this interaction we have shown that it inhibits cellular response to type I and type II interferon, and then it inhibits also antiviral effects of these interferons. Then we have investigated the mechanisms of this inhibition, and we have shown that cytoplasmic P protein inhibits nuclear accumulation of STAT1 in response to interferons. Yet this mechanism does not seem to be absolutely necessary to inhibit interferon response, since nuclear forms of P, especially the short product P3, inhibit interferon response without inhibiting nuclear accumulation of STAT1. Therefore, we have searched another inhibition mechanism in order to explain this fact, and we have found that P and P3 are able to inhibit DNA binding of STAT1 in response to interferon. These results demonstrate that P protein could use two different mechanisms in order to inhibit more effïciently cellular interferon response. P and N are the major components of Negri bodies whose function is still unknown until now. Then we have achieved a proteomic analysis in order to identify other viral and cellular components of these bodies. We have found several cellular proteins involved in translation, suggesting that Negri bodies could be viral factories. Another cellular partner of Negri bodies is the heat shock protein HSP70. We have shown that HSP70 cellular expression is induced during rabies infection, and that this protein has a proviral function for rabies virus. The mechanisms of this function are still unknown, and we are investigating whether HSP70 localization in Negri bodies is necessary for these mechanisms.