Translocation de lipides non marqués mesurée par changements de forme de vésicules géantes : le cas de la céramide

Unlabelled lipid translocation measured by shape changes in giant vesicles : the case of ceramide

• Auteur / Autrice : Ivan Lopez-Montero
• Direction : Philippe F. Devaux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique moléculaire
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transport biologique actif

Transporteurs ABC

Métabolisme lipidique

Protéines de transfert des phospholipides

Céramides

Résumé

Une asymétrie de surface de 0. 1 % entre les deux monocouches dans des vésicules géantes (GUVs) suffit pour déclencher un changement de leur forme. L'incorporation des molécules exogènes dans le feuillet externe d'une vésicule prolate produit la formation d'un bourgeonnement. La redistribution par diffusion transversale (flip-flop) des molécules dans les deux feuillets induit la récupération à la forme prolate. Le temps moyen de flip-flop spontané des molécules non marqués incorporées peut être calculé à partir des temps mesurés des deux transitions de forme. Un temps de flip-flop inférieur à une minute à 37 °C a été mesuré pour la céramide naturelle (C6-Cer, C10-Cer, C16-Cer). La méthode a été validée par des mesures spectroscopiques (RPE) du flip-flop d'analogues de céramide dans des LUVs. Les changements de forme des vésicules permettent également la détection du flip-flop de lipides endogènes par des protéines possédant une fonction de translocation lipidique (flippases). Nous avons reconstitué la P-gP (purifiée) et l'aminophospholipide translocase (à partir de membrane de globule rouge humain) dans des GUVs. L'activation de ces protéines par l'ajout d'ATP à l'extérieur des vésicules produit des changements des formes en accord avec un transport lipidique actif.

A 0. 1% of surface asymmetry between both monolayers of giant vesicles (GUVs) suffices to trigger shape changes in vesicles. The incorporation of exogenous molecules to the external leaflet of vesicles produces a shape change from prolate to pear that is reversed when the molecules redistribute in both monolayers, by transmembrane diffusion (flip-flop). The spontaneous flip-flop half-time of unlabelled molecules can be inferred by measuring the time of both shape transitions. A half-time for unlabeled ceramide (C6-Cer, C10-Cer, C16-Cer) flip-flop below 1 min at 37°C was measured. The method was validated by spectroscopic measures (EPR) of labelled ceramide flip-flop in LUVs. Shape changes in vesicles can also be used to detect the flip-flop of endogenous lipid by the action of a flippase protein. A purified P-gP and the Aminophospholipid Translocase were reconstituted into GUVs. The protein activation by the addition of external ATP produced vesicle shape changes according to an active lipid transport.