Développements méthodologiques pour la caractérisation des complexes ADN-protéines par AFM et étude des interactions ADN-KU

par Fabrice Landousy

Thèse de doctorat en Interfaces Physique - Biologie

Sous la direction de Eric Le Cam.

Soutenue en 2006

à Paris 7 .

mots clés

• Microscopie à force atomique
• Microscopie électronique
• ADN

Résumé

La microscopie a force atomique (afm) ouvre de nouvelles perspectives dans l'etude des interactions adn-proteines. Mon travail a consiste a developper de nouvelles methodologies pour controler l'adsorption de l'adn sur les surfaces et permettre l'etude en liquide de la dynamique des complexes. Nous avons caracterise les interactions entre l'adn et la surface de mica. Nous proposons un modele simple pour decrire les interactions electrostatiques en solution entre l'adn et le mica, en considerant le role des cations monovalents et divalents. La bonne correlation avec les donnees experimentales permet de valider un referentiel de conditions et une methode d'adsorption reversible de l'adn sur mica pretraite nickel. Nous avons parallelement developpe un systeme de plots pour ancrer l'adn par ses extremites. Le controle de ces methodologies permet de caracteriser l'accessibilite en fonction des etats d'adsorption. Nous abordons cette problematique en caracterisant l'activite de la bleomycine sur l'adn. Cette approche sur un systeme modele permet de caracteriser l'influence de la surface en termes d'accessibilite et d'activite. La derniere partie de ce travail considere la caracterisation des interactions de la proteine ku avec l'adn dans le cadre de l'etude de la reparation des cassures double brin. Notre approche qui combine les apports de la microscopie electronique a transmission et de l'afm met en evidence une polymerisation cooperative de ku sur l'adn double brin et un mode de fixation tres different sur l'adn simple brin. Ce travail montre l'interet de l'imagerie moleculaire pour caracteriser les mecanismes de recherche des sites cibles par les proteines

Titre traduit

Methodological developments for the characterization of Dna-protein complexes by AFM and study of Dna-ku interactions

Résumé

Atomic force microscopy (afm) opens new perspectives in the study of dna-protein interactions. My work consisted of developing new methodologies for controlling dna adsorption on surfaces and enabling the study of the dynamics of the complexes in liquid. We have characterized the interactions between dna and the mica surface. We propose a simple model to describe the electrostatic interactions in solution between dna and mica, considering the role of monovalent and divalent cations. The good correlation with experimental data allows validating referential adsorption conditions and a reversible adsorption method for dna on nickel-pretreated mica. In parallel we have developed a system of tethers to anchor dna by its extremities. The control of these methodologies allows characterizing accessibility in function of the adsorption states. We broach this issue by characterizing bleomycin activity on dna. This approach on a model system allows characterizing the surface influence in terms of accessibility and activity. The last part of this work considers the characterization of the interactions of the ku protein with dna, in the frame of the study of dna double-strand break repair. Our approach which combines the contributions of transmission electron microscopy and of afm shows a cooperative polymerization of ku along dna and a very different binding mode on single-stranded dna. This work shows the interest of molecular imaging for the characterization of target site research mechanisms by proteins.