Étude structurale de la nucléoprotéine du virus de la rage

par Aurélie Albertini

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Rob W. H. Ruigrok.

Soutenue en 2006

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015) .

mots clés

• Structure cristallographie
• Protection de l'ARN
• Virus rabique
• Virus à ARN négatif
• Nucléoprotéines
• Phosphoprotéines
• Électrophorèse

Résumé

Le virus de la rage appartient à l'ordre des Mononegavirales. Ces virus sont enveloppés, et leur génome est composé d'une seule molécule d'ARN de polarité négative. Dans le cas du virus de la rage, cet ARN encode cinq protéines virales dont la nucléoprotéine (N) qui est fortement impliquée dans la réplication et la transcription du virus. L'objectif de mon travail de thèse consistait à obtenir des informations structurales à la meilleure résolution possible sur la nucléoprotéine (N) du virus de la rage, ceci afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la multiplication virale. La nucléoprotéine existe sous deux formes: en complexe« soluble» avec la phosphoprotéine (P), ou associée à l'ARN viral. Le complexe N-ARN viral est la matrice utilisée par l' ARN-polymérase pour effectuer la transcription et la réplication. Il est possible de produire de manière recombinante des complexes N-ARN en forme d'anneaux composés d'un nombre de nucléoprotéines allant de 9 à 15 sous-unités par complexe. La mise au point d'une technique biochimique pour purifier ces différentes espèces suivie d'études en microscopie électronique et en cristallographie aux rayons X ont conduit à l'obtention d'un modèle atomique à une résolution de 3. 5 Å. L'ultrastructure du complexe dont la structure a été résolue est formée par l'association entre II nucléoprotéines et un brin d'ARN de 99 bases. Il s'agit de la première structure de nucléoprotéine d'un virus à ARN négatif associée à son substrat, l'ARN. Cette structure permet de constater que la nucléoprotéine séquestre étroitement l'ARN limitant ainsi la formation d'ARN double brin et le protégeant de la réponse immunitaire innée. Pour devenir accessible à la polymérase virale, l' ARN génomique du virus de la rage doit être dissocié localement de quelques protomères de nucléoprotéine. Ce mode de fonctionnement spécifique existe probablement pour d'autres virus comme celui de la rougeole, Ebola ou la grippe, responsables eux aussi de pathologies humaines graves. La nucléoprotéine est une cible antivirale intéressante puisqu'elle n'existe qu'au sein des virus.

Pas de résumé disponible.

Titre traduit

Crystal structure of rabies virus nucleoprotein

Résumé

Rabies virus, a member of the Mononegavirales family, constitutes a serious health problem in developing countries lacking effective vaccination programs. The genome of negative-strand RNA viruses is compacted by the nucleoprotein (N) resulting in an N-RNA complex forming a tight helical nucleocapsid. That is packaged into enveloped virions. Transcription and replication in the cytoplasm upon virus infection requires the N-RNA as a template for the RNA dependent RNA-polymerase complex. When N is expressed in insect cells in the absence of the other viral proteins, the protein binds to cellular RNA molecules and ringshaped N-RNA complexes are produced. These rings are made up of 9 to 15 nucleoproteins subunits. We have been able to separate these distinct size classes and crystallised the complex containing II N-protomers and an RNA molecule of 99 ribonucleotides. The crystals diffracted to a resolution of 3. 5 A. The nucleoprotein subunit is composed of two domains that clamp around the RNA at their interface and shield it off from the environment, representing the replication inactive N-RNA conformation of the nucleocapsid inside the virus particle. Polymerisation of the nucleoprotein protomers is achieved by domain exchange between monomers acting as two hinges. The flexibility allowed by these hinges permits the formation of long N-RNA complexes adopting the larger helical radius required for nucleocapsid formation. The sequestering of the RNA within N indicates that the RNA has to dissociate from a monomer to become a template for the polymerase complex. Other negative-strand RNA viruses such as filoviruses, paramyxoviruses, borna viruses and influenza viruses may use the same structural principles to assemble a helical nucleocapsid. The nucleoprotein is an interesting target for drug design as it only exists in viruses. This thesis also contains the first experiments describing the characterization of the binding of the phosphoprotein, the polymerase co-factor, to the N-RNA complex.