Nouveaux inhibiteurs de topoisomérase II dérivés de la 4'-déméthylépipodophyllotoxine dirigés sur des séquences spécifiques de l'ADN : conception, synthèse et applications

par Maria Duca

Thèse de doctorat en Biochimie moléculaire

Sous la direction de Thérèse Garestier-Hélène et de Paola Barbara Arimondo.

Soutenue en 2005

à Paris, Muséum national d'histoire naturelle , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) , en partenariat avec Muséum national d'histoire naturelle. Département de préhistoire (Paris) (autre partenaire) .

Le jury était composé de Claude Monneret, Marc Fontecave, Jian-Sheng Sun, Paola Barbara Arimondo.

Les rapporteurs étaient Anna Garbesi, Christian Bailly.

mots clés

• Topoisomérase II
• Étoposide
• Podophyllotoxine -- Dérivés -- Emploi en thérapeutique
• Triple-hélice

Résumé

La topoisomérase II est une enzyme ubiquitaire, essentielle à la viabilité de tous les organismes, qui contrôle et modifie l'état topologique de l'ADN en coupant transitoirement les deux brins de la double-hélice d'ADN. Cette enzyme est la cible cellulaire d'un grand nombre de molécules, comme les dérivés de la 4'-déméthylépipodophillotoxine: ces molécules stabilisent le complexe transitoire ADN/TopoII, où chaque brin de l'ADN est coupé et lié de façon covalente à une sous-unité de l'enzyme, et empêchent ainsi la religation de l'ADN. Parmi les dérivés de la 4'-déméthylépipodophyllotoxine, l'étoposide est couramment utilisé en thérapie anticancéreuse, mais il présente des limitations importantes. Nous avons donc synthétisé de nouvelles séries de dérivés de la podophyllotoxine en modifiant deux parties de la molecule: le substituant en position 4 et le cycle lactonique D. Nous avons ensuite vérifié pour chaque dérivé l'activité d'inhibition de l'enzyme topoisomerase II et certains produits ont montré une activité superieure à celle de l'étoposide. Le couplage d'agents antitumoraux, inhibiteurs de topoisomérase I, à des oligonucléotides formant une triple-hélice (OFT) permet de diriger la coupure par la topoisomérase I vers une cible spécifique dans la cellule, comme l'ADN d'un agent pathogène ou une famille de gènes impliqués dans le processus tumoral. Dans cette perspective, nous avons couplé les dérivés le plus actifs à des OFT et étudié la capacité de ces conjugués à diriger la coupure par la topoisomérase II spécifiquement au site triple-hélice. Après la validation de la stratégie in vitro, nous avons employé les conjugués dans un contexte cellulaire. Nous avons choisi comme cible le gène mdr1, responsable de la résistance multiple aux médicaments, et obtenu l'inhibition de son expréssion par un conjugué OFT-daunorubicine

Résumé

DNA topoisomerase II is an ubiquitous and essential enzyme that modulates DNA topology by passing an intact DNA double helix through a transient double-stranded break. This enzyme plays critical roles in a number of DNA processes. Topoisomerase II is the primary cellular target for a large number of anticancer agents, like 4'-demethylepipodophillotoxin derivatives. These molecules stabilise the DNA/TopoII complex, and induce DNA breaks. This action converts topoisomerase II into a potent cellular toxin that fragments the genome and induces cell death. Among 4'-demethylepipodophyllotoxin derivatives, etoposide is widely used in anticancer therapy, however it presents several limitations, such as poor water solubility, development of drug resistance, metabolic inactivation and toxic effects. Therefore, we synthesized new series of etoposide analogs by introducing different substituents in 4-position, like carbamate or sulfonamide chains. Then we evaluated the effect on topoisomerase II and the cytotoxicity. The conjugation of antitumor agents, such as topoisomerase I inhibitors, allowed to direct the cleavage mediated by topoisomerase I to specific sites of the genome. On this basis we synthesized new conjgates between the new topoisomerase II inhibitors and triplex forming oligonucletides (TFO) and evaluated their ability to recruit topoisomerase II and direct its cleavage to specific DNA sequences. This targeting strategy allows to obtain topoisomerase II-mediated DNA cleavage at specific sequences of DNA, like a gene involved in cancer development. We choose to target mdr1 gene which is responsible of multidrug resistance. We obtained the inhibition of its expression by using a conjugate TFO-daunorubicine. These conjugates are also a biochemical tool to study the molecular mechanism of action of etoposide and its analogs