Microscopie électrochimique pour l'élaboration et la caractérisation de bio-assemblages sur électrode : application aux biopuces

par Elodie Fortin

Thèse de doctorat en Chimie et sciences du vivant

Sous la direction de Pascal Mailley et de Sabine Szunerits.

Soutenue en 2005

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015) .

mots clés

Résumé

L'objectif de ce travail est double : (i) la détection électrochimique des nucléosides sur un nouveau matériau carboné d'électrode, le diamant dopé bore (BDD), et (ii) l'utilisation d'un nouvel outil, la microscopie électrochimique à balayage (SECM), afin de fonctionnaliser des surfaces avec des sondes oligonucléotidiques et de détecter le phénomène d'hybridation. Dans un premier temps, nous montrerons la dualité d'utilisation de la microscopie électrochimique en tant qu'outil de fonctionnalisation et de caractérisation de surfaces. Par mode direct de la SECM, en utilisant la microélectrode en tant que contre-électrode, des spots de polypyrrole-oligonucléotide de taille micrométrique sont déposés sur un substrat d'or. Cette méthode d'élaboration est optimisée en étudiant l'hybridation des spots en microscopie de fluorescence. La présence de ces spots sur la surface est ensuite détectée en mode feedback de la SECM via la différence de conductivité entre le polypyrroleoligonucléotide et l'or. Puis, le phénomène d'hybridation est étudié par mode feedback par la précipitation d'un produit isolant sur la surface formé par une réaction catalysée par la peroxydase couplée par l'intermédiaire d'un assemblage biologique à l'oligonucléotide complémentaire. Enfin, cette technique électrochimique est couplée à une méthode optique, l'imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi), afin de visualiser en temps réel l'étape de structuration de la surface d'or par des spots d'oligonucléotides ou par des gradients de surface d'oligonucléotides. Dans un second temps, nous présenterons l'étude des réactions d'oxydation des nucléosides, la 2'-désoxyguanosine et la 2'-désoxyadénosine, sur une électrode de diamant dopée bore oxygéné. Nous montrerons ainsi l'intérêt de ce nouveau matériau carboné d'électrode pour cette application en raison de sa large fenêtre d'électroinactivité en milieu aqueux et son faible et stable courant de fond. Puis, nous mettrons en évidence la formation d'un film continu constitué des produits de ces réactions d'oxydation sur l'électrode par une étude macroscopique à l'aide de voltamétries cycliques d'une sonde redox, et une étude à l'échelle microscopique en utilisant le microscope électrochimique à balayage.

Titre traduit

Scanning electrochemical microscopy for the elaboration and the caracterization of bio-assemblies on electrode : application to biosensors

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Résumé

This work deals with : (i) the electrochemical detection of nucleosides on a new carbon electrode material, Boron Doped Diamond (BDD), and (ii) the use of a recent apparatus, scanning electrochemical microscopy (SECM) to micropattern surfaces with oligonucleotides and to detect the hybridization event. On the one hand, we illustrate the capacity of scanning electrochemical microscopy to micropattern and characterize surfaces. By direct mode of SECM, using the microelectrode as a counter electrode, polypyrrole-oligonucleotide spots with micrometric dimensions are deposited on a gold surface. This patterning method is optimized studying the spots hybridization by fluorescence microscopy. By the difference in surface conductivity between gold and polypyrrole-oligonucleotide, SECM can detect the spots on the gold surface using the feedback mode. Then, the hybridization event is detected using the feedback mode by the precipitation of an insulating product on the surface generated by the reaction catalysed by the peroxidase which is coupled by a biological assembly to the complementary oligonucleotide. Finally, this electrochemical method is coupled to an optical one, Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi), to visualize in real time the patterning step of the gold surface with oligonucleotide spots or surface oligonucleotide gradients. On the other hand, the oxidation reactions of both nucleosides, 2'-deoxyguanosine and 2'-deoxyadenosine, are performed on an oxygenated boron doped diamond electrode. This points out the interest of this new material thanks to its enlarged potential window in aqueous media and its little and stable background current. Then, we show the formation of a continuous film of oxidized products on the BDD surface by a macroscopic study analysing cyclic voltametries of a redox mediator, and in a microscopic way with the use of scanning electrochemical microscopy.