Caractérisation et production de protéines impliquées dans le système de défense " inné " des poissons
par Yannick Bessin
Thèse de doctorat en Biochimie. Biologie moléculaire. Biophysique
Sous la direction de Gérard Molle.
Soutenue en 2004
à Rouen .
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Résumé
Le mucus épidermique de poisson contient de nombreux composés lui conférant un rôle de protection contre les microorganismes. Récemment plusieurs protéines antibactériennes ont été isolées des fractions hydrophobes des mucus épidermiques d'anguille, de tanche et de truite. Ces protéines possédaient une forte activité antibactérienne corrélée à une activité "formeur" de pores, responsable de la perméabilisation des membranes bactériennes. La première partie de ce travail a consisté à montrer que de telles protéines étaient présentes dans le mucus d'un poisson d'eau de mer. A partir du mucus de turbot une protéine de 55 kDa, possédant de telles activités, a été isolée et caractérisée. Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes intéressés à la protéine de 65 kDa de truite (Tr65). A partir d'une banque d'ADNc de la peau et des séquences primaires de fragments protéiques obtenus après digestions, le gène de Tr65 a pu être identifié. Le fort caractère hydrophobe de Tr65 et sa puissante activité antibactérienne ont rendu impossible sa production dans différents systèmes in vivo ou in vitro. En suivant les prédictions de structure secondaire et surtout la position des hélices transmembranaires, Tr65 a été découpée en trois fragments qui ont été produits et purifiés avec succès. Seuls les fragments possédant les hélices transmembranaires ont pu restaurer l'activité "formeur" de pores. Par contre, l'activité antibactérienne n'a pu être retrouvée. Ce résultat peut s'expliquer par, (i) leur forte insolubilité dans les milieux permettant la croissance bactérienne, (ii) des problèmes de conformation comme le suggèrent des expériences de dichroi͏̈sme circulaire.
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Titre traduit
Characterisation and production of proteins involved in innate defense of fishes.
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Résumé
Many compounds are present in skin mucus of fishes were they serve as the first line of defence against bacterial invasion. Recently, several antibacterial proteins have been extracted from mucus of eel, tench and trout. These proteins have strong antimicrobial activity correlated to a pore forming properties inducing permeabilisation of bacterial membranes. In the first part of this work, we have identified a 55 kDa hydrophobic protein with such activities in the mucus of a sea fish, the turbot. In a second part, we have studied the 65 kDa protein of trout (Tr65). Tr65 gene was identified from skin cDNA library and from primary sequences of digested protein fragments. Due to its strong hydrophobic nature and antibacterial activity, Tr65 could not be successfully produced in in vivo and in vitro systems. According to secondary structure predictions, Tr65 was successfully produced as three protein fragments: N-terminal and C-terminal fragments containing transmembrane helices and a middle one. The segments with transmembrane helices were the only ones to show pore-forming activity in planar lipid bilayers. In contrast no antibacterial activity was observed with any segments. This last result can be explained by: (i) the high insolubility of the segments in bacterial culture media, (ii) the unfolding of the segments as revealed by circular dichroism measurements.
