Analyse des interactions des récepteurs GPCR exprimés dans l'épithélium lingual humain avec les pseudo particules virales du VPH 11

• Auteur / Autrice : Lukasz Durzynski
• Direction : Anna Gozdzicka-Josefiak, Thomas Haertlé
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Nantes en cotutelle avec Poznan
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie biologie (Nantes....-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Langue (anatomie) -- Maladies

Papillomavirus

Résumé

Des prélèvements dans la gorge et sur la langue de 101 enfants sains ont été réalisés pour évaluer la présence de l'ADN du VPH de type 11. La prévalence virale dans la population asymptomatique a atteint 20%. Les tests ELISA utilisant la protéine L1 obtenue dans deux systèmes d'expression (E. Coli et les cellules d'insectes) ont été mis en place afin de détecter les anticorps des séra prélevés chez les patients présentant les papillomes au niveau de la langue. Les pseudo particules virales composées de la protéine L1 (Bac-to-Bac) ont été détectées à la surface de cellules réceptrices gustatives de souris (bourgeons du goût) lors d'un essai immuno-histochimique avec les anticorps primaire et secondaire appropriés. Ces résultats ont été approfondies pour répondre à la question de ma thèse: "Les protéines de type GPCR, impliquées dans la perception gustative ou olfactive, peuvent-elles servir de molécules d'adhésion pour les virus de papilloma humains à tropisme nasopharyngal ?" Les pseudo particules virales VLP-VPH11-L1 ont été produites pour remplacer les virions infectieux. L'utilisation du virus VPH11 n'a pas été possible car la lignée cellulaire permettant l'amplification et la maturation virale in vitro n'existe pas. Les VLPs de virus de papilloma peuvent remplacer les virions puisqu'ils possèdent les mêmes propriétés antigéniques et conformationnelles. En conséquence, il est légitime de supposer que les VLPs se comportent de la même façon que les virions quant à la reconnaissance des molécules cellulaires de surface. L'ADNc des gènes humains OLR exprimés dans l'épithélium lingual a été caractérisé sur la base des homologies de séquences de quelques domaines transmembranaires (Abe et al. 1993 a/b). Les gènes OLR sélectionnés, OR7A5 et OR6Q1 ont été clone��s dans les vecteurs d'expression procaryote et JCG5 dans le vecteur d'expression eucaryote. Le gène du premier récepteur décrit du goût amer, T2R4 (Adler et Hoon, 2000) a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote en tant que témoin car les autres GPCR engagés dans la perception du goût sucré (ex. T1R) n'ont été caractérisés que deux ans plus tard (Nelson et Chandrashekar, 2002). Les protéines JCG5 et OR7A5 produites chez E. Coli ont été incubées avec les VLP-VPH11-L1 mais aucune interaction n'a été détectée dans le test ELISA.

Before starting the work 101 children were screened in order to assess HPV type 11 DNA presence. The virus prevalence in asymptomatic population was assessed to reach about 20 %. ELISA tests were developed allowing detection of antibodies in sera from patients subjected to lingual papillomatosis removal using L1 of HPV type 11 protein from two expression systems (E. Coli and Bac-to-Bac in insect cells). Subsequently L1 virus-like particles of HPV type 11, obtained using insect cell expression system, were detected on murine taste receptor cell surface (taste buds) by visualization with an appropriate set of primary and secondary antibodies in immunohistochemical assay. These results were investigated further in a set of experimental models to answer the hypothesis of my PhD: "Do the GPCR proteins implicated in taste or odour perception serve as adhesion molecules for papilloma viruses with tropism to upper nasopharyngal epithelia?" Following steps were performed:The virus-like particles VLP-HPV11-L1 were produced to replace infectious HPV type 11 virions. The use of HPV11 virus was impossible since there is no cell line allowing its maturation and amplification in vitro. Papilloma virus VLPs, as it was described in introduction of this thesis, can replace native virions, displaying similar antigenic properties, almost the same conformation. Consequently one may assume that they will have similar behaviour as far as the recognition of cell surface adhesion molecules is concerned. CDNA of OLR human genes expressed in human lingual epithelium was characterized on the basis of sequence homology of several transmembrane domains (Abe et al. 1993 a/b). Selected OLR genes: JCG5, OR7A5 and OR6Q1 were cloned into procaryotic expression vector and JCG5 into the eucaryotic vector. The first described human bitter taste receptor gene T2R4 (Adler and Hoon, 2000) was cloned in the eucaryotic expression vector as a control since other GPCR engaged in sweet taste perception (T1R) were characterized two years ago (Nelson and Chandrashekar, 2002) The OLR proteins JCG5 and OR7A5 produced in E. Coli were incubated with VLP-HPV11-L1 particles but no interaction was observed in ELISA assay. HEK-293 (human embryonic kidney) cells expressing JCG5 and T2R4 proteins on their surface, were incubated with VLP-HPV11-L1 particles. HEK-293 cells with heterologously expressed JCG5 protein have had an increased affinity to VLP particles. Results obtained from the experiments indicate that JCG5 transmembrane protein may play a role of adhesion molecule for human papilloma virus type 11.