Modification des ARNt par une protéine " Radical SAM " : étude de la protéine MiaB

Study of the MiaB protein, a " Radical SAM " enzyme involved in tRNA modification

• Auteur / Autrice : Fabien Pierrel
• Direction : Marc Fontecave, Mohamed Atta
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Grenoble 1

Résumé

Les ARNt sont des molécules clés de la machinerie traductionnelle puisqu'ils assurent le décodage exact des codons successifs de l'ARN messager (ARNm) au sein du ribosome, permettant ainsi la synthèse de la protéine correspondant à l'ARNm. Les ARNt matures ont une taille comprise entre 73 et 95 nucléotides dont beaucoup sont constitués de nucléosides modifiés (86 différents ont été identifiés). Nous nous sommes intéressés à l'un de ces nucléosides modifiés, la 2-méthylthio-N6-isopentenyladénosine (ms2i6A) présente en position 37 de certains ARNt. La biosynthèse de ms2i6A peut être divisée en 2 étapes : d'une part une réaction bien caractérisée qui correspond à l'ajout d'un groupement isopentenyle en position N6 de l'adénosine 37 par la protéine MiaA et d'autre part une étape de thiométhylation de la position 2 de l'isopentenyladénosine 37 (i6A-37). Avant ce travail, les seules choses connues sur cette seconde étape étaient qu'elle nécessite la présence de S-Adénosylméthionine (SAM), de fer, de L-cystéine et qu'elle implique au moins la protéine MiaB. Au cours d'études in vivo et in vitro, nous avons pu montrer que la protéine MiaB est une protéine à centre Fe-S appartenant à la famille récemment identifiée des protéines " Radical SAM " qui utilisent un mécanisme d'activation radicalaire particulier. Nous avons également mis en évidence que MiaB catalyse à la fois les réactions de thiolation et de méthylation de la position 2 de i6A-37. La réaction complexe de formation de la liaison C-S sur le carbone aromatique non activé de i6A-37 reste incomprise mais quelques éléments de réponse sont apportés aux nombreuses questions posées.

Transfer RNAs (tRNAs) are key molecules of the translation mecanism because they perform the exact decoding of the messenger RNA (mRNA) inside the ribosome, allowing the synthesis of the protein corresponding to the mRNA. Mature tRNAs constist of 73 to 95 nucleotides among which modified nucleosides are found (86 different modified nucleosides identified to date). We studied one of these modified nucleosides : the 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A) which is present at position 37 of some tRNAs. The biosynthesis of ms2i6A is divided in 2 steps : first, a well characterized reaction of isopentenylation of the N6 position of adenosine 37 catalyzed by the MiaA protein and second, a methylthiolation of the 2 position of isopentenyladenosine 37 (i6A 37). At the beginning of our work, we knew only that this second step requires S-Adenosylmethionine (SAM), iron, L-cysteine and that at least one protein was involved in the reaction : the MiaB protein. With different in vivo and in vitro studies, we have shown that MiaB is a Fe-S containing protein which belongs to the recently identified " SAM Radical " superfamily. Members of this family use a particular radical activation mecanism. We have also shown that MiaB catalyzes both thiolation and methylation reactions of position 2 of i6A 37. The reaction of formation of the C-S bond onto the aromatic non reactive carbon atom 2 of i6A 37 is not yet understood but we bring some elements to answer the different questions which remain.