La recombinaison spécifique de site chez les archaea : propriétés de l'intégrase du fusellovirus SSV1

par Claire Bordes-Letzelter

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Michel Duguet.

Soutenue en 2003

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

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Résumé

SSV1 est un fusellovirus découvert chez l'archaea thermoacidophile Sulfolobus shibatae B12. SSV1 s'intègre dans le génome de son hôte par un mécanisme de recombinaison spécifique de site catalysé par l'intégrase virale, IntSSV. La réaction intervient entre un site ADN chromosomique attB et un site viral attP. Une bonne connaissance du cycle vital ainsi que la maîtrise du système d'intégration/excision sont des étapes essentielles au développement d'un vecteur performant basé sur SSV1. Nous avons développé différents tests d'activité pour étudier le mécanisme catalytique d'IntSSV. Nous avons de plus généré des mutants ponctuels d'IntSSV ainsi que des mutants ponctuels du site attP. L'étude de ces différents sites et protéines a révélé certaines propriétés de SSV1. En particulier, nous avons montré que l'affinité d'Intssv pour ses sites est faible, mais meilleure pour attP que pour attB, suggérant que des protéines accessoires sont nécessaires à la réaction de recombinaison. La position exacte de la coupure a été identifiée sur un substrat synthétique dérivé du site atfP. L'étude de mutants ponctuels du site attP a mis en évidence des positions importantes pour que la coupure intervienne. Des mutations ponctuelles qui bloquent l'activité de coupure de la protéine ont ainsi été identifiées. L'analyse des propriétés des mutants d'Intssv a montré que cette intégrase fait partie de la famille des tyrosine recombinases, et que l'organisation du site actif de cette protéine d'archae est de type eucaryote. L'introduction dans le génome viral de mutations affectant soit l'intégrase soit le site attP est en cours. L'étude de ces virus mutants permettra d'identifier la forme réplicative de SSV1, et donc de mieux comprendre le cycle viral.

Résumé

SSV1 is a fusellovirus isolated from the thermoacidophilic archaeaon Sulfblobus shibatae B12. SSV1 integrates into its host genome by site-specific recombination catalyzed by the viral integrase IntSSV. The reaction occurs between a chromosomal DNA site (attB) and a viral DNA site (attP). The development of an efficient vector based on SSV1 requires to better know the viral cycle as well as a good insight of the integration/excision mechanism. We have developed several assays to study the catalytic mechanism of IntSSV. Furthermore we have generated point mutants of Intssv and of the attP site. Studies on these different sites and proteins revealed some properties of SSV1. In particular, we have shown that Int affinity for its sites is low, although better for attP than for attB, suggesting that accessory proteins may be required for the recombination reaction. The exact cleavage position has been identified on a synthetic substrate derived from the attP site. The study of point mutants of the attP site further revealed that some positions are important for cleavage to occur. Some mutations that abolish cleavage by IntSSV have been identified. Analysis of the properties of Intssv mutants has shown that this integrase is a member of the tyrosine recombinase family, and that the architecture of its active site is of eucaryotic type. We are currently introducing into the viral genome some mutations affecting either the integrase or the attP site. Analysis of these mutant viruses behaviour will allow identification of the SSV1 replicative form, hence leading to a better knowledge of the viral cycle.