Implication de la protéine kinase C de Leishmania dans le phénomène d'invasion : cible potentielle des imidazolidin-2-one

Implication of Leishmanial protein kinase C during invasion process. Molecular target of imidazolidin-2-one compounds

• Auteur / Autrice : Nidia Fernanda Alvarez Rueda
• Direction : Patrice Le Pape
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie. Parasitologie
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Nantes

Mots clés

Mots clés contrôlés

Imidazoline

Protéine kinase C

Leishmaniose

Résumé

Récemment identifiée chez des protozoaires parasites, la protéine kinase C (PKC) a été impliquée, à l'instar d'autres modèles cellulaires, dans les processus de prolifération mais également dans les mécanismes d'invasion des parasites intracellulaires. En ce qui concerne les leishmanies, peu de données sont disponibles à ce jour. Dans ce travail, nous avons mis en évidence une activité PKC dépendante du Ca2+ et de la phosphatidylsérine chez les promastigotes de Leishmania (L. ) mexicana, L. (L. ) major et L. (L. ) infantum. Le pré-traitement des parasites avec 50 nM d'un inhibiteur sélectif de la PKC , le RO-32-0432, réduit l'activité enzymatique de 72 %. Un anticorps monoclonal (2B9) dirigé contre la PKC I II permet de détecter par immunoempreinte dans les fractions subcellulaires une bande de 56 kDa correspondant à la sous-unité catalytique de l'enzyme. L'expression de cette enzyme dépend de la phase de croissance du parasite puisque une augmentation très significative n'est observée qu'à partir du 6ème jour de culture. Cette expression dépend également de l'interaction hôte-parasite car le contacte de parasites au 4ème jour de culture avec les macrophages murins entraîne une augmentation des niveaux d'expression de la PKC. Ces résultats sont corrélés avec le maximum d'infectivité des promastigotes (4ème et 6ème jours de culture). Par ailleurs, le pré-traitement des leishmanies avant invasion avec 100 nM de l'inhibiteur RO-32-0432 réduit de 58 % le nombre de macrophages parasités et de 72 % la charge parasitaire, ce qui suggère la participation de la PKC dans le processus d'invasion. Dans un second temps, l'activité antileishmanienne in vitro des dérivés imidazolidin-2-one précédemment rapportés comme des inhibiteurs de la phospholipase A2 de Leishmania, a été évaluée. Lorsque les parasites sont traités par le dérivé imidazolidin-2-one JM278 à une concentration voisine de sa CI50 (10 M), l'activité PKC est réduite de 80 %. A cette même concentration, le dérivé JM278 réduit de 70 % le nombre de macrophages parasités. Le modèle in vivo chez la souris Balb/c a montré que le JM278 réduit de 25 % la charge parasitaire du foie et de 44 % la charge parasitaire de la rate. L'ensemble de ces résultats montre que la l'activité du type PKC est présente chez les promastigotes de Leishmania spp. Et qu'elle pourrait être une cible thérapeutique pour la nouvelle famille de dérivés imidazolidin-2-one.

Recently identified in protozoan parasites, the protein kinase C (PKC) was implicated in a multitude of cellular processes as cell proliferation and differentiation. Little is known regarding PKC biological functions in Leishmania spp. In this work, a Ca2+/phophatidylserine-dependent PKC activity was detected in L. (L). Mexicana, L. (L). Major and L. (L). Infantum promastigotes using an ELISA system: a monoclonal antibody that recognizes the phosphorylated form of a synthetic PKC/PKA pseudosubstrate. Pretreatment of parasites with 50 nM of RO-32-0432 the selective PKC I bisindolylmaleimide inhibitor leads to an important reduction of enzyme activity (72 %). Immunoblotting analysis with a monoclonal anti-PKC I II revealed a 56 kDa band corresponding to the enzyme catalytic subunit. A marked increase in enzyme expression has been detected only in cultures entered into 6th growth day (stationary stage). In spite of PKC-expression absence during 4th culture day, an increase in the PKC levels was observed when parasites were put in contact with macrophages, whereas the infectivity of Leishmania is maximum at the 4th and 6th day of culture. In addition, promastigotes pretreatment with 100 nM RO-32-0432 inhibitor reduced by 58 % the number of infected macrophages and by 72 % the parasite burden. We also evaluated the antileishmanial activity of imidazolidin-2-one derivatives. Pretreatment of parasites with 10 M of compound JM278 inhibited 80 % of PKC activity. At the same concentration, this compound inhibited 70 % of parasite-host cell invasion process. In vivo model showed that compound JM278 reduced liver parasite burden by 25 % and spleen parasite burden by 44 %. These results provide the first evidence that PKC plays a critical role in the invasion process. This Leishmania PKC activity could be a relevant therapeutic target and imidazolidinone novel antileishmanial candidates.