Détection et estimation de la viabilité des kystes de Giardia par biologie moléculaire en vue d'une application à l'analyse de prélèvements de l'environnement

par Mélinda Maux

Thèse de doctorat en Biologie santé environnement. Chimie et microbiologie de l'eau

Sous la direction de Janine Schwartzbrod.

Soutenue en 2003

à Nancy 1 , en partenariat avec Université de Nancy I. UFR Sciences pharmaceutiques et biologiques (autre partenaire) .


  • Résumé

    L'évaluation du risque parasitaire passe par le développement de stratégies d'analyses efficaces, sensibles et spécifiques qui peuvent permettre non seulement de détecter le parasite, mais aussi d'estimer sa viabilité faute de pouvoir disposer d'un outil fiable pour déterminer son pouvoir infectieux. Parmi lestrois protozoaires les plus fréquemment retrouvés au niveau mondial, Giardia est présent sous la forme de kyste dans l'environnement. En fonction de ces éléments, cette étude a pour objectif de développer des outils de biologie moléculaire pour réaliser la détection des kystes de Giardia et l'évaluation de leur viabilité. La première partie de ce travail a permis de définir une méthode d'amplification de l' ADN par semi-nested PCR analytique et de l' ARN par RT semi-nested PCR analytique de kystes de Giardia purifiés à partir de selles de malades, en partant de trois gènes cibles et spécifiques de Giardia: l'HSP 70,1' ADHE et la Giardine. Aucun fragment amplifié n'a été obtenu avec les amorces HSP 70, des produits d'amplification ont été observés à la suite d'une semi-nested PCR avec le gène de l' ADHE, et pour la dernière cible, la Giardine, des résultats positifs sont enregistrés aussi bien en PCR qu'en RT-PCR. Pour parvenir à ces résultats, un protocole d'extraction pour chaque acide nucléique (ADN et ARN), des conditions optimales d'amplification pour chaque cible (HSP, ADHE et Giardine), ainsi qu'un traitement de l'extrait ARN par une DNase pour s'affranchir de l'amplification exclusive de cet acide nucléique ont été successivement sélectionnés. Dans nos conditions d'expérimentation, le seuil de détection de la semi-nested PCR est fixé pour la Giardine à 6 kystes et de la RT semi-nested PCR à 3 kystes. En partant de ces outils d'analyses, des études de survies en fonction de la température et d'impactd'un choc thermique sur la morphologie et l'expression des kystes de Giardia ont été réalisées. Les résultats d'estimation de la viabilité par RT-PCR analytique ont également été comparés à ceux obtenus en microscopie optique après marquage des kystes par des colorants vitaux. Globalement, quelles que soient les conditions d'incubation (température et temps), nos expérimentations ont démontré la persistance de l' ADN et de l' ARN par PCR et RT -PCR respectivement. L'estimation de la viabilité déterminée par RT-PCR n'est pas cohérente avec celle issue de l'observation au microscope optique en épi fluorescence qui permet d'enregistrer une baisse de la viabilité d'autant plus importante que la température est éloignée de l'intervalle 4-20ʿC et que le temps d'incubation est important. D'après ces résultats, la disponibilité de l'ADN et de l'ARN ne semble pas être diminuée par le stockage des kystes de Giardia aux différentes températures, probablement grâce à la persistance des acides nucléiques et/ou l'absence de modification dans le métabolisme de l' ARNm. Dans une seconde partie du travail, à partir des acides nucléiques des mêmes parasites, les conditions d'amplification de l' ADN et de l' ARN, respectivement en PCR et en RT-PCR quantitatives, ont été définies en prenant toujours pour cible la séquence de la Giardine. A l'issue de l'optimisation des conditions d'amplification, le protocole de PCR quantitative est validé sur la base d'une reproductibilité supérieure à 95 %, d'un rendement estimé à 88% et d'un seuil de détection fixé à 6 kystes de Giardia. Dans le cas de la RT-PCR quantitative, le traitement enzymatique par la DNase ne modifie ni le rendement (94 %) ni la sensibilité de la détection. Il permet d'assurer, avec une variabilité inférieure à 5 %,l'amplification exclusive de l' ARN à partir de 3 kystes de Giardia. En utilisant la méthodologie Jle PCR et RT-PCR quantitatives développée et l'observation au microscope optique en épifluorescence, les mêmes études de survies en fonction de la température et de l'impact d'un choc thermique sur la morphologie et l'expression des kystes de Giardia ont été réalisées. Les résultats de l'estimation de la viabilité ont également été comparés successivement à ceux obtenus en microscopie optique. Cette fois, la persistance de l' ADN est vérifiée plus précisément par des valeurs d'abattement proche de zéro et quelles que soient les conditions d'expérimentation. Concernant l' ARNm, les résultats de RT -PCR permettent dans certaines conditions d'enregistrer de faibles abattements, alors qu'à l'issue de l'examen en microscopie optique il est possible de vérifier l'absence de kystes viables. Nos expérimentations ont démontré qu'il était possible d'amplifier de façon sensible et spécifique le génome de Giardia (ARN et ADN) aussi bien par PCR analytique que par PCR quantitative. En revanche pour l'évaluation de la viabilité des kystes de Giardia, seule la PCR quantitative fournit les informations nécessaires pour apprécier le pouvoir infectieux.


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Informations

  • Détails : 208 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 192-208

Où se trouve cette thèse\u00a0?

  • Bibliothèque : Université de Lorraine (Vandoeuvre-lès-Nancy, Meurthe-et-Moselle). Direction de la Documentation et de l'Edition - BU Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T/D/PH/N/2003/15
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