Thèse soutenue

Production et glycosylation d'EPO par cellules CHO : caractérisation par électrophorèse capillaire au cours de procédés discontinus
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Auteur / Autrice : François Le Floch
Direction : Annie Marc
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Procédés biotechnologiques et alimentaires
Date : Soutenance en 2003
Etablissement(s) : Vandoeuvre-les-Nancy, INPL

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Ce travail a pour objectif d'améliorer la maîtrise de la glycosylation des protéines recombinantes produites par culture de cellules animales, ceci par l'étude de l'influence du procédé de culture sur la structure glycannique d'une protéine modèle: l'érythopoi͏̈étine (EPO) produite par cellules CHO. La construction du système d'étude a d'abord nécessité plusieurs étapes: la génération d'un clone CHO producteur d'EPO performant, la mise au point d'une méthode de purification de la protéine par immuno- affinité et l'adaptation d'une technique d'analyse de la glycosylation aux contraintes de notre système. Deux paramètres particuliers du procédé de culture ont donc été plus précisément étudiés au cours de ce travail: l'avancement de la culture et la présence de sérum dans le milieu. L'étude du suivi de la glycosylation de l'EPO en cours de culture discontinue avec sérum a mis en évidence une désialylation progressive de la protéine durant la deuxième partie de la culture, de même qu'une lyse cellulaire importante. Une activité sialidasique significative ayant également été observée simultanément, une dégradation enzymatique faisant suite à la lyse cellulaire semble être à l'origine de ce phénomène en présence de sérum. Après adaptation des cellules au milieu sans sérum, la désialylation de l'EPO s'est par contre révélée stable tout au long des cultures réalisées en l'absence de sérum. L'étude de la glycosylation de l'EPO produite en présence de sérum par des cellules adaptées à la culture sans sérum a montré que la désialylation de l'EPO était directement liée à la présence de sérum, et non à la procédure d'adaptation des cellules au milieu sans sérum. En conclusion, cette étude a mis en évidence l'influence significative que pouvait avoir certains paramètres du procédé de culture sur la qualité de l'EPO produite par notre système.