La lipase pancréatique humaine : Purification, propriétés catalytiques et propriétés de fluorescence

Human pancreatic lipase:purification and catalytic properties. Fluorescence properties

• Auteur / Autrice : Paul Ramos
• Direction : Georges Férard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences Pharmaceutiques.Biochimie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Strasbourg 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fluorescence

Catalyseurs

Pancréas

Lipases

Résumé

Ce travail de thèse est articulé autour de deux parties. La première traite de la purification de la lipase pancréatique humaine et de l'étude de ses propriétés catalytiques. Dans une deuxième partie, plus fondamentale, les propriétés de fluorescence de la lipase pancréatique humaine ont été étudiées. La lipase a été purifiée à partir de deux origines : suc pancréatique humain et lipase pancréatique humaine recombinante. Les propriétés catalytiques des deux enzymes purifiées ont été déterminées en titrimétrie à pH constant. Elles ont été trouvées identiques à celles de l'enzyme présente dans le plasma de patients atteints de pancréatite aigue͏̈. De plus, la stabilité des deux préparations d'enzyme purifiée s'est révélée être excellente. Par ailleurs, les 2 préparations sont commutables avec les spécimens provenant de patients. Elles ont été certifiées par cinq laboratoires (le nôtre ayant coordonné l'étude) de quatre pays différents. Ces résultats et les lots de ces deux matériaux ont été transmis au Bureau Communautaire de Référence (Bruxelles) pour enregistrement. Ces deux matériaux amélioreront la cohérence des résultats des mesures de l'activité enzymatique de la lipase lors d'études en enzymologie fondamentale et clinique. Nous avons dans la deuxième partie mené des études en fluorescence de la lipase pancréatique sauvage et de différents mutants où un tryptophane a été remplacé par une phénylalanine. La lipase pancréatique sauvage possède trois durées de vie distinctes. Seule la mutation du tryptophane 30 a entraîné la disparition de la durée de vie la plus longue caractérisant ainsi la participation de ce tryptophane à la fluorescence totale de la protéine. Le tryptophane 30 est très proche du clapet recouvrant le site actif de la lipase en conformation fermée (non active). Nous avons pu attribuer la durée de vie longue au tryptophane 30, ce qui donne un moyen bien adapté pour suivre grâce à la fluorescence des variations structurales et sans doute fonctionnelles de cette partie importante de la protéine lors de son activation par les sels biliaires et la colipase. L'étude de la fluorescence de la lipase en présence de colipase et/ou de sels biliaires en suivant la durée de vie longue de la protéine a montré des différences significatives par rapport aux caractéristiques de fluorescence de la lipase F30 sans aucun effecteur (conformation " fermée "). Cet outil devrait permettre d'identifier facilement la conformation inactive et active grâce à la mesure de la durée de vie longue de la lipase pancréatique humaine.

This work of thesis is articulated around two parts. The first part describes the purification of human pancreatic lipase and the study of its catalytic properties. In a second part, more fundamental, the properties of fluorescence of human pancreatic lipase were studied. Lipase was purified starting from two origins: human pancreatic juice and recombinant human pancreatic lipase. The catalytic properties of the two purified enzymes were studied in titrimetry at constant pH. They were found identical to those of the enzyme present in the plasma of patients suffering from acute pancreatitis. Moreover, the stability of the two preparations of purified enzyme proved to be excellent. In addition, the two preparations are commutable with the specimens coming from patients. They were certified by five laboratories (ours having coordinated the study) from four different countries. These results and the batches of these two materials were transmitted to the Bureau Communautaire de Référence (Brussels) for recording. These two materials will improve the comparability of results of measurements of the enzymatic activity of lipase in fundamental and clinical enzymology studies. In the second part we carried out the studies in fluorescence of wild pancreatic lipase and various mutants where a tryptophan was replaced by a phenylalanine. Wild pancreatic lipase has three distinct lifetimes. Only the change of tryptophan 30 involved the disappearance of the longest lifetime thus characterizing the contribution of this tryptophan in the total fluorescence of protein. Tryptophan 30 is very close to the lid covering the catalytic site with lipase in closed conformation (non active). We can attribute the long lifetime to tryptophan 30, which gives a convenient tool to follow with fluorescence the structural and likely functional variations of this important part of the protein during its activation by biliary salts and colipase. The study of the fluorescence of lipase in the presence of colipase and/or biliary salts by following the long lifetime of protein showed significant differences compared to the characteristics of fluorescence of F30 lipase without any effector (closed conformation). This tool should allow to easily identify inactive and active conformation thanks to measurement of the long lifetime of human pancreatic lipase.