Microscopie par génération du second harmonique : applications à l'imagerie cellulaire

• Auteur / Autrice : Laurent Moreaux
• Direction : Serge Charpak
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Microscopie non linéaire

Shg

Microscopie bi-photonique

Tpef

Chromophores

Neurones

Résumé

La microscopie bi-photonique est la forme de microscopie non linéaire la plus populaire pour l'imagerie des cellules biologiques. Une forme moins populaire basée sur la génération du second harmonique (SHG) par des surfaces ou par des tissus endogènes a été cependant utilisée plusieurs années avant l'invention de la microscopie bi-photonique. En raison des difficultés d'interprétation du signal, la microscopie SHG a été peu exploitée jusqu'à un regain d'intérêt récent. Cette thèse présente une analyse expérimentale et théorique de la microscopie par génération du second harmonique utilisée pour l'imagerie des membranes biologiques dans lesquelles des sondes exogènes sont insérées. En particulier, ce travail démontre la possibilité de combiner à la fois SHG et fluorescence bi-photonique pour l'imagerie des membranes dans lesquelles des chromophores sont insérés. Nous montrons que les résolutions deux microscopies sont identiques, ce qui rends les deux modes de contrastes optiques facilement combinables dans un seul et même instrument. Grâce à un modèle basé sur la théorie des antennes, nous avons établi l'expression de la puissance totale rayonnée, de la distribution angulaire et des propriétés de polarisation du SHG en champ lointain dans le cas de chromophores parfaitement alignés ou non dans la membrane. De plus, nous avons défini une section efficace SHG afin de permettre un comparaison direct avec la fluorescence induite par absorption à deux photons. Malgré leurs similitudes, la SHG et la fluorescence bi-photonique sont des phénomènes intrinsèquement différents. Le premier est cohérent et le second ne l'est pas. Nous montrons que cette différence offre de nouvelles possibilités pour l'étude de l'organisation moléculaire. Enfin, nous présentons une technique permettant d'étudier la nature de la réponse à un champ électrique trans-membranaire dans le but d'une application directe de la microscopie par SHG à l'imagerie des potentiels membranaires.

By far the most well known form of non-linear microscopy is based on two-photon excited fluorescence (TPEF), which bas now become a laboratory standard for biological imaging. A lesser known form of this microscopy, however, was used several years prior to the invention of TPEF microscopy, based on the generation of second harmonic light either from surfaces or from endogenous tissue structures. Because of difficulties in signal, second-harmonic generation (SHG) microscopy has gone by relatively unnoticed until only very recently. This work present a detailed experimental and theoretical analysis of the generation of second-harmonic radiation from biological membranes labeled with exogenous markers. We demonstrate that simultaneous second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence can be used to image biological membranes labeled with properly designed chromophore. Moreover, we show that spatial resolutions provided by SHG and TPEF microscopies are commensurate, meaning that the two contrast modes can very often be conveniently derived from the same instrument. Based on phased-array antennas model, we derive expressions for the SHG radiation power, angular distribution and polarization dependence in the cases of ideal or non-ideal molecular alignment in the membrane. We define an SHG cross-section similar to that used in two-photon excited fluorescence to allow direct comparison. Despite their similarities, however, SHG and TPEF are fundamentally different phenomena. The first is coherent whereas the second is not. We demonstrate, moreover, that this basic difference provides a unique window into molecular spatial organization which is inaccessible to fluorescence. At least, we present a screening technique to quantify and ascertain the nature of the second-harmonic generation response of chromophores to a trans-membrane electric field. These results are specifically directed to the optimisation of membrane potential response in SHG microscopy.