Thèse soutenue

Dédoublement enzymatique d'acides alpha-halogéno aryl acétique : Approche expérimentale et modélisation moléculaire
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Auteur / Autrice : David Guieysse
Direction : Pierre Monsan
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie - Santé. Biotechnologie
Date : Soutenance en 2002
Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

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Résumé

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L'étude a porté sur le dédoublement d'acides alpha-halogéno aryl acétique catalysé par les lipases. Ces composés sont utilisés pour la synthèse de molécules pharmaceutiques, ou autres, optiquement pures. Dans un premier temps, plusieurs lipases (RML, PCL, CALB, CRL, HLL) ont été testées pour leur capacité à dédoubler l'alpha-bromo-o-tolyl acétate d'éthyle en réaction de transestérification avec l'octanol. Une énantiosélectivité maximale de E=11,3 a été obtenue avec la lipase de R. Miehei immobilisée sur polypropylène, laquelle est plus sélective que la lipase libre. D'autre part, la lipase de P. Cepacia s'est révélée être beaucoup plus énantiosélective pour les substrats portant la substitution méthyle en position méta et para sur le cycle aromatique (E>50). Dans un deuxième temps, parmi tous les paramètres susceptibles de modifier l'énantiosélectivité de la lipase de P. Cepacia pour le dédoublement de l'alpha-bromo phényl acétate d'éthyle, nous avons mis en évidence que la sélectivité de la lipase était fortement influencée par la nature de l'halogène du centre asymétrique ainsi que par la nature nucléofuge de la partie alkyle du substrat. L'immobilisation du biocatalyseur modifie également la sélectivité de la lipase. Enfin, par modélisation moléculaire, nous avons identifié les processus moléculaires responsables de la sélectivité de la lipase de P. Cepacia pour l'énantiomère (R) de l'alpha-bromo phényl acétate d'éthyle (E=57). L'approche que nous avons suivie n'a jamais été décrite dans la littérature. Pour la première fois, en retraçant les trajectoires de chaque énantiomère dans le site actif de la lipase et sur la base des énergies d'interaction enzyme/substrat, nous avons montré que le site actif de l'enzyme est moins accessible à l'énantiomère (S) qu'à l'énantiomère (R). Un réseau d'acides aminés hydrophobes à chaînes latérales pivotantes (Val, Leu), tapissant les parois du site actif, semble intervenir dans le cheminement du substrat vers le site actif. En particulier, deux acides aminés Val-266 et Leu-17 forment un goulot d'étranglement qui semble intervenir dans la discrimination des énantiomères. La détermination de l'énantiosélectivité du mutant V266L porteur à la position 266 d'une chaîne latérale plus encombrante a confirmé ce résultat. En effet, pour ce mutant, la taille du goulot d'étranglement est réduite et l'énantiosélectivité est supérieure à 200.