Clonage et expression chez E. Coli des trois sous-unités du complexe ternaire de la procarboxypeptidase A du pancréas de boeuf (Analyse par modélisation moléculaire de la non association entre les sous-unités I et II chez l'homme et le porc)

par Rachid Seddi

Thèse de doctorat en Biochimie. Nutrition, aspects moléculaires et cellulaires

Sous la direction de Xiao Jun Guo.

Soutenue en 2002

à Aix-Marseille 3 .

mots clés

• Escherichia coli
• Clonage moléculaire
• Peptidases

Résumé

L'expression de trois protéases pancréatiques de boeuf, procarboxypeptidase (PCPA), chymotrypsinogène C (CTGC) et proprotéase E (PPE), dans un système hétérologue, est essentielle à l'étude de leurs interactions. L'ADNc de la procarboxypeptidase ayant déjà été isolé au sein de notre laboratoire (Le Hue͏̈rou et al. , 1991), nous avons réalisé le clonage des ADNc du CTGC et de la PPE à partir d'une banque d'ADNc de pancréas de boeuf. Les ADNc clonés ont été exprimés chez E. Coli. Les trois protéines hétérologues synthétisées sont fréquemment exprimées sous forme de corps d'inclusions, quel que soit le système d'expression utilisé et malgré plusieurs essais d'optimisation. Nous avons été amenés à tester un nouveau système d'expression (pET32) qui favorise la solubilisation des protéines hétérologues chez E. Coli grâce, d'une part, au milieu cytoplasmique réduit des souches hôte de type ADA 494 (déficienctes en thiorédoxine réductase) et, d'autre part, aux rôle de chaperon que peut jouer la protéine de fusion, thiorédoxine. L'incubation des souches recombinantes ADA494 (pET/CPA) à la température de 15ʿC à permis de synthétiser environ 30% de PCPA intracellulaire soluble. Cette PCPA soluble exprimée, purifiée puis soumise à l'action de la trypsine s'est révélée active. L'utilisation des mêmes conditions expérimentales n'a pas abouti à des résultats positifs avec le CTGC et de la PPE. Toutes les tentatives d'optimisation effectuées n'ont pas permis la détection d'activité protéasique dans le CTGC et la PPE recombinantes, après leur activation trypsique. L'étude de modélisation moléculaire a permis, grâce aux séquences peptidiques de la PCPA et du CTGC de porc (Darnis et al. , 1997; Darnis, communication personnelle) et de l'homme (Catasùs et al. , 1992; Tomomura et al. , 1996), de réaliser une prédiction de la structure tridimensionnelle de ces protéines. Par ailleurs, la comparaison des structures tridimensionnelles et l'analyse de la région d'interaction entre la PCPA et le CTGC chez l'homme et le porc, par rapport au boeuf, à conduit à proposer certains résidus comme essentiels au maintien de l'interaction entre la PCPA et le CTGC chez le boeuf. La substitution de ces résidus est donc très probablement à l'origine de la non association entre ces deux protéines chez l'homme et le porc.

Titre traduit

Cloning and expression in E. Coli of the subunit from procarboxypeptidase A ternary complex in the bovine pancreatic (Molecular modeling analysis of the non association between subunits I andII in borth human and porcin species)

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Résumé

The expression of three bovine pancreatic proteases, namely procarboxypeptidase A (PCPA), chymotryposinogen C (CTGC) and proprotease E (PPE) in a heterologous system is useful for studying their mutual interactions. Besides the PCPA cDNA which has previously been isolated in our laboratory (Le Huerou), both CTGC and PPE cDNA were cloned from a pancreatic bovine cDNA library, and the three cDNA were subsequently expressed in E. Coli. The three heterologous proteins were found to be synthesised as inclusion bodies, whatever the expression system used. Another expression system (pET 32) which is known to increase the solubility of heterologous proteins in E. Coli was used. When PCPA was expressed under the control of bacteriophage T7 promoter in E. Coli ADA494 (a thioredoxine reductase deficient bacteria), as much as 30% of the corresponding thioredoxine fusion proteine was recovered in a soluble form at 15ʿC growth temperature. The soluble PCPA was subsequently purified and incubated with trypsin at 40 : 1 (w/w) ratioto give rise to carboxypeptidas A. Unfortunately, CTGC and PPE thioredoxine fusion proteines were found not to be activatable. Using molecular modelling analysis the tridimensional structures of CTGC and PCPA wer predicted on the basis of their amino acid sequence. Further analysis of the interaction region between PCPA and CTGC allowed us to suggest some residues are essential for the non-covalent association of PCPA to CTGC. All these residus were not conserved in both the human and porcin enzymes it is strongly suggested that the corresponding mutations are responsible for the non association of PCPA and CTGC in human and porcin pancreatic secretion.