Mise en évidence et caractérisation d'activités RGI-galactosyltransférases dans une suspension cellulaire de lin (linum usitatissimum L. )

par Isabelle Peugnet

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de Claudine Morvan.

Soutenue en 2001

à Rouen .

mots clés

• Linum usitatissimum
• Galactane
• Pectine
• Biosynthèse
• Activité enzymatique
• Culture cellulaire
• Caractérisation
• Cinétique
• Isozyme
• Purification
• Galactosyltransférase
• Lin -- Pectine
• Galactanes
• Génie tissulaire

Résumé

Les rhamnogalacturonanes de type I (RGI) sont des composés pectiques importants des parois primaires des cellules végétales. Les RGI sont différemment substitués par des chaînes latérales plus ou moins longues et riches en galactose. D'après Mohnen (1999), trois types de galactosyltransférases sont impliqués dans l'initiation et l'élongation des chaînes des β (1→4) galactanes ramifiant les RGI. Plusieurs galactosyltransférases, capables de transférer un résidu galactosyle à partir d'UDP-galactose sur un accepteur polysaccharidique, ont été solubilisées à partir d'une fraction microsomale de cellules de lin (linum usitatissimum L. ) avec du CHAPS 0,5%. L'utilisation du RGI de lin comme substrat exogène pour stimuler l'activité galactosyltransférase solubilisée a permis la mise en évidence d'une activité RGI-galactosyltransférase dans ces cellules. Un test enzymatique a été mis au point par chromatographie d'exclusion stérique pour mesurer spécifiquement les produits de la RGI-galactosyltransferase. En utilisant une RGlyase ou une RGhydrolase purifiée, les produits radiomarqués ont été caractérisés comme étant un RGI polymérique. A pH 8 en présence de 5 mM de CaCl2, les résidus β galactosyles sont transférés spécifiquement sur un RGI ramifié par de courtes chaînes latérales de β (1→4) galactanes, qui peuvent être hydrolysés par une β-galactosidase ou une endo-β (1→4)-galactanase. Une activité galactosyltransférase de type II a donc été identifiée dans des suspensions cellulaires de lin. Cette RGI-galactosyltransférase a une température optimale de 30°C et est inactivée au delà de 48°C. Le Km apparent pour l'UDP-galactose et le RGI exogène est respectivement de 460 ± 40 micromoles et 1,1 ± 0,1 mg mL-1 et le Vmax est de 3,0 ± 0,5 pkat mg-1 de protéines. La RGI-galactosyltransférase possède au moins deux isoformes, l'une neutre et l'autre basique. Les sous-unités catalytiques potentielles de l'enzyme auraient une masse moléculaire comprise entre 25 000 et 50 000. Des essais de purification sur gels d'affinité ainsi que des expériences de photo-marquage, couplées à différentes techniques électrophorétiques (SDS-PAGE, isofocalisation électrique en agarose et électrophorèse bidimensionnelle), ont permis d'identifier plusieurs spots protéiques pouvant correspondre a une galactosyltransférase. Un séquençage de ces spots permettra de confirmer ces hypothèses.

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