Interactions d'agents antitumoraux avec la neocarzinostatine : ingénierie combinatoire par exposition sur phage

par Guilhem Lerat

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Philipppe Minard.

Soutenue en 2001

à Paris 11 .

mots clés

• @Apo-néocarzinostatine
• @Mutagenèse aléatoire
• @Exposition sur phage
• @Banque combinatoire protéique
• @Criblage
• Doxorubicine
• Mutagenèse

Résumé

L'apo-néocarzinostatin est une protéine transportant un chromophore. Cette protéine est aussi capable de fixer la doxorubicine, une molécule utilisée en thérapie anti-cancéreuse. La néocarzinostatin est une proteine stable, susceptible d'être modifié afin de lui conférer la capacité de cibler la doxorubicine par reconnaissance de récepteurs cellulaires spécifiques. L'affinité de la neocarzinostatin pour la doxorubicine est de 10mM, ce qui est trop faible pour envisager l'utilisation de ce complexe. Le but de ce travail est d'augmenter l'affinité de la protéine pour le composé chimique par mutagenèse aléatoire. La mutagenèse affectera uniquement les résidus du site de fixation n'étant pas en interaction avec la doxorubicine. Le criblage de la banque combinatoire est réalisé en utilisant la technique d'exposition sur phage. La banque combinatoire construite se caractérise par une taille permettant l'exploration exhaustive du répertoire. Il n'y a aucun biais notable. Le criblage de la banque est réalisé de manière à sélectionner les mutants présentant une meilleur affinité pour la doxorubicine. Le criblage se révèle délicat en raison de l'instabilité du gène de la néocarzinostatine, ce dernier étant délété par recombinaison au cours des tours de sélection. Le criblage de la banque a permis d'isoler plusieurs clones capable de fixer la doxorubicine. Parmi ces différents clones, un seul possède une phase ouverte de lecture correcte permettant d'exprimer de la neocarzinostatine. Ce mutant de la neocarzinostatine se caractérise par la présence de glutation au niveau du site de fixation. L'affinité de ce mutant pour la doxorubicine est plus mauvaise que celle de la neocarzinostatine sauvage. L'élimination du glutation n'améliore pas l'affinité.

Titre traduit

Interactions of antitumoral agents with neocarzinostatin : ingeniery by phage display

Résumé

The apo-néocarzinostatin is a protein which carries a chromophore. This protein is also able to fix doxorubicin, a molecule used in anti-cancerous therapy. The néocarzinostatin is a stable protein, which can be modified in order to give it the ability to target the doxorubicin with the specific cellulars receivers recognition. The neocarzinostatin affinity for the doxorubicine is about 10 mM, which is too weak to use this kind of complex. The goal of this work is to increase the protein affinity of the chemical composition thanks to the aleatory mutagen. The mutagen will only affect the residues of the fixation site since they do not interact with the doxorubicin. The combinative bank sifting is carried out with the use of the exhibition technic on phage. The combinative bank is characterized by a dimension, which facilitates the repertory large exploration. There is not any other remedy. The bank sifting is carried out in order to select the mutants who seem to have more affinity with the doxorubicine. The sifting seems very difficult due to the neocarzinostatin gen instability, this one deleted by recombination during the selections. The bank sifting permits to isolate several clons able to fix the doxorubicin. Among these different clons, only one have a correct opened stage of reading, which can produce neocarzinostatin. This neocarzinostatin mutant is characterized by the presence of glutation found in the fixation site. This mutant affinity towards the doxorubicin is more bad than the one of the brute neocarzinostatin. The glutation elimination does not improve affinity.