Caracterisation fonctionnelle du site actif de l'aminopeptidase a par mutagenese dirigee. Mise en evidence de nouveaux motifs consensus des aminopeptidases monozincs

• Auteur / Autrice : Xavier Iturrioz
• Direction : Catherine Llorens-Cortes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

L'aminopeptidase a (ec 3. 4. 11. 7, apa) est une glycoproteine membranaire homodimerique de 260 kda. L'apa est caracterisee par une specificite de substrat stricte en hydrolysant exclusivement les acides amines en position n-terminale des peptides. La specificite de substrat de l'apa est renforcee par la presence d'un atome de ca2+ par monomere d'enzyme qui augmente l'affinite de l'enzyme pour les substrats acides. L'apa est impliquee in vivo dans la cascade enzymatique du systeme renine-angiotensine cerebral, ou elle clive l'aspartate n-terminal de l'angiotensine ii pour donner naissance au peptide effecteur de ce systeme, l'angiotensine iii. L'etude du role physiologique de cette enzyme necessite le developpement d'inhibiteurs specifiques et selectifs dont la structure peut etre definie a partir de la modelisation de son site actif. Afin d'etablir ce modele, nous avons entrepris d'explorer la topologie du site actif de l'apa par mutagenese dirigee. L'apa possede dans sa sequence primaire le motif hexxh caracteristique des metallopeptidases a zinc. Les premiers travaux de mutagenese dirigee realises sur l'apa ont mis en evidence la fonctionnalite du motif hexxh et plus particulierement le role du glutamate constituant ce motif (glu 386) dans l'acte catalytique. Ils ont egalement montre l'implication du zinc dans la catalyse enzymatique et permis d'identifier les ligands du zinc, comme les deux histidines du motif hexxh et un glutamate (glu 408) situe 24 acides amines en aval de ce motif. L'absence de donnees cristallographiques sur les aminopeptidases monozines, rend difficile l'approche moleculaire que nous avons entreprise. Nous avons base nos etudes sur les alignements de sequence primaire de l'apa avec d'autres aminopeptidases monozines, mais egalement avec des endopeptidases a zinc bien caracterisees sur le plan structural comme la thermolysine et l'endopeptidase neutre 24. 11. Les alignements de sequence ont revele l'existence de plusieurs residus conserves parmi les aminopeptidases monozincs. Parmi ceux-ci nous avons etudie la tyr 471 presente dans un motif conserve yxkg, le glu 352 et l'asn 353 du motif xxmen caracteristique des aminopeptidases monozincs ainsi que l'his 450, un residu non conserve dans l'aminopeptidase b, une enzyme ayant une specificite de substrat inverse de celle de l'apa. Afin de caracteriser le role fonctionnel de ces differents residus, nous les avons substitues par mutagenese dirigee, puis nous avons caracterise l'enzyme mutee et l'enzyme sauvage biochimiquement et enzymatiquement. Ceci nous a permis de mettre en evidence que la tyr 471 intervient dans l'acte catalytique en stabilisant l'etat de transition via une interaction entre l'hydroxyle de la tyrosine et l'oxyanion de l'intermediaire tetraedrique. L'etude du motif xxmen et plus particulierement des residus glu 352 et asn 353 a revele l'implication de ces acides amines dans la specificite exopeptidase de l'apa, faisant de ce motif la signature des aminopeptidases monozincs. Nous avons ensuite caracterise l'his 450 et avons etabli que ce residu jouait un role important dans la liaison du substrat, en interagissant avec la chaine laterale du residu acide n-terminal. L'his 450 contribue ainsi, avec le calcium, a la specificite de substrat de l'apa pour les acides amines n-terminaux acides. L'ensemble de ces donnes nous a permis de proposer un modele de l'organisation du site actif de l'apa et du mecanisme catalytique putatif base sur celui de la thermolysine. L'utilisation de ces informations a contribue au developpement de nouveaux inhibiteurs de l'apa, plus specifiques et plus selectifs. Comme nous l'avons demontre l'ang iii cerebrale, formee sous l'action de l'apa, exerce un effet stimulateur tonique sur le controle central de la pression arterielle, ces nouveaux inhibiteurs pourraient donc constituer des antihypertenseurs potentiels a action centrale.