Validation et caractérisation de la lecture des puces à ADN par spectroscopie de fluorescence
par Marlène Bras
Thèse de doctorat en Sciences. Chimie
Sous la direction de Jean-Paul Chauvet.
Soutenue en 2001
à Lyon 1 .
Le jury était composé de Jean-Paul Chauvet.
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Résumé
L'analyse des gènes est un sujet au cœur de l'actualité. Les grandes avancées de la biologie moléculaire de ces dernières années étaient limitées par le décryptage des séquences d'ADN. Les biopuces basées sur le principe de la reconnaissance de la molécule d'ADN permettent d'accéder à ce type d'informations et sont développées depuis quelques années. Le travail effectué au cours de cette thèse s'inscrit dans le cadre du projet ROSA dont le but est de mettre au point un outil d'analyse performant. La principale technique de détection utilisée pour la lecture des puces à ADN est la spectroscopie de fluorescence. Une présentation des différents types de puces à ADN ainsi que du principe de la fluorescence nous conduit à dégager les différents problèmes posés. Dans un premier temps, la validation des différentes étapes de fabrication, par synthèse directe, ou par accrochage d'oligonucléotides présynthétisés, ainsi que la comparaison de différents types de fonctionnalisation du support, permettent de choisir les conditions les mieux adaptées à l'obtention d'une puce fonctionnelle. Dans un deuxième temps, l'utilisation d'un substrat en silicium avec une épaisseur d'oxyde "accordée" à la longueur d'onde d'excitation entraîne la diminution de la limite de détection de la lecture des puces à ADN par fluorescence, facteur limitant cette technique. Enfin, la reproductibilité et la capacité de réutilisation des différents types de support montrent la fiabilité de la fabrication et les performances de la technique de lecture. Nous avons également tenté de poser les bases d'une analyse quantitative.
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Titre traduit
Validation and optimisation of DNA chips reading by fluorescent spectroscopy
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