Couplage orienté de protéines recombinantes sur des polymères de synthèse : étude des mécanismes et analyse de la bioréactivité

Oriented immobilization of recombinant proteins onto synthetic copolymers : investigation of the mechanisms and analysis of the bioreactivity

• Auteur / Autrice : Laure Allard
• Direction : Bernard Mandrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences. Ingénierie médicale et biologique
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bernard Mandrand

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anhydride maléique

Protéines immobilisées

Lysine

Bioconjugués

Protéines recombinées

Résumé

L'immobilisation de protéines peut être requise dans divers domaines d'application tels que le diagnostic médical ou la thérapie génique. Cependant, le processus d'immoblisation peut altérer l'activité biologique de la protéine. L'objectif de ce travail est la mise au point d'un système générique de couplage orienté de protéines recombinantes sur des polymères de synthèse permettant de conserver l'activité biologique après immobilisation. La protéine modèle retenue pour l'étude est la protéine p24 de capside du virus de l'immunodéficience humaine et le support d'immobilisation est un copolymère d'anhydride maléique et de méthyl vinyl éther. Le couplage, basé sur la réaction entre les amines primaires des protéines et les groupements anhydride maléique du polymère, conduit à la formation d'une laison amide. La réaction de couplage a été modulée par introduction de groupements réactifs (tags) sur la protéine et par hydrolyse ménagée du polymère. L'incidence de la composition et de la position du tag sur l'efficacité de couplage a été étudiée. Plus spécifiquement, il a été montré que l'efficacité du couplage est directement corrélé à la densité d'amines primaires et de charges dans le tag. Des mesures d'accessibilité d'épitopes et de sites de protéolyse ont permis de montrer l'incidence de la position du tag dans la protéine et de la densité de groupements réactifs sur le polymère sur la conservation des propriétés biologiques de la protéine immobilisée. Finalement, l'utilisation d'un bioconjugué protéine-polymère, en phase de capture dans un test ELIS, permet de détecter de très faibles quantités d'anticorps dans les sérums de patients infectés par le VIH-1, conduisant à une amélioration la sensibilité du test

Protein immobilization is often required for many applications such as diagnostic or gene therapy. Nevertherless, the immobilization process may alter the biological activity of the protein. The aim of this work is to achieve a generic system allowing the control of the orientation of proteins covalently bound onto copolymers without loss of the biological properties. The model protein retained for the investigation is the HIV-1 p24 capsid protein and the immobilization support is a maleic anhydride alterned copolymer. The coupling reaction takes place between the primary amines of the protein and the anhydride moities of the polymer leading to the formation of an amid bond. Proteins were modified by introducing sequence tags coding for reactives residues and the reactivity of the polymer was decrease by partial hydrolysis. The influence of the composition and the position of the tag within the protein was investigated. We demonstrated that the coupling efficiency depends directly on the primary amine and charge density of the tag. Then, the biological activity of the immobilized proteins was investigated using monoclonal antibodies and anzymatic disgestion. The position of the tag and the reactivity of the polymer are the two main parameters involved in the preservation of the biological activity of the immobilized protein. Finaly, using a proteins -polymer bioconjugate as a capture phase in an ELISA test allows detection of lower antibodies level in HIV-1 positives sera leading to an enhancement of the sensivity of the test