Immobilisation d'oligonucléotides par greffage sur silice pour la réalisation de "puces à ADN"

Oligonucleotide immobilization by grafting on silica for "DNA CHIP" achievement

• Auteur / Autrice : Vincent Dugas
• Direction : Eliane Souteyrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Images et systèmes
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Ecully, Ecole centrale de Lyon
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'électronique, optoélectronique et microsystèmes (Ecully, Rhône)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Silice

ADN

Oligonucléotides

Mots clés libres

Immobilisation d'oligonucléotides

Réseau d'oligonucléotides

Hybridation sur support

Puces à ADN

Greffage

Silane

Silicium

Résumé

Un procédé d'immobilisation d'ADN de manière covalente, robuste et reproductible a été développé dans le cadre de ce travail. La méthode sélectionnée pour l'immobilisation des brins d'ADN consiste à faire réagir des oligonucléotides porteurs d'une amine primaire terminale sur les surfaces. La réaction sur des acides activés crée des liaisons covalentes de type amide très stables chimiquement. La fonctionnalisation du support est obtenue par greffage chimique du[diméthyl(diméthylamino)silyl] undécanoate de tertiobutyle, déprotection des fonctions ester et activation au N-hydroxysuccinimide (NHS) des fonctions acide formées. Le choix d'un silane monofonctionnel permet d'obtenir des greffages plus reproductibles qu'avec les silanes trifonctionnels habituellement utilisés. Les densités de greffage dépendent du nombre de silanols présents en surface de l'échantillon. Ainsi des densités de greffage de 1,4 micron mol/m2 ont été mesurées par FTIR-ATR sur de la silice thermique qui possède une faible densité de silanols. Les fonctions acide sont obtenues en conditions douces par formation d'ester de silyle facilement hydrolysable dans l'eau. La réaction des oligonucléotides modifiés par un aminolinker sur les acides activés au NHS se fait à partir de solutions diluées grâce à un séchage in situ des gouttes déposées. Cette méthode donne des densités d'immobilisation, après lavage, de 4xlO puiss. 11 brins/cm2. Ces supports permettent d'hybrider des oligonucléotides complémentaires et des fragments PCR doubles brins de 1,5 kb. Le greffage covalent permet d'utiliser ces dispositifs dans des cycles d'hybridation / dénaturation successifs.

A process of covalently, reliability and reusability of DNA immobilization has been developed in this work. The selected method for the immobilization of DNA strand consists to make reaction between oligonucleotides carrying terminals primaries amines with the surfaces. The reaction on activated acids creates covalent bounds of very chemically stable amide type. The substrate functionalization is performed by chemical grafting of the t-butyl [dimethyl (diméthylamino) sily] undecanoate following with a deprotection step of the ester and activation of the leading acids with the N-hydroxysuccinimide (NHS). The choice of a monofunctional silane allows to obtain more reproducible grafting than with the usually trifunctionals used. The grafting densities depend of the number of silanols presents on the surface sample. Thus grafting densities of 1. 4 micron mol/m2 have been measured by FTIR-ATR on thermal silica that possess a low density of silanols. The acid function are generated under mild conditions by formation of silyl ester easily hydrolysable with water. The reaction of amino-modified oligonucleotides on NHS ester activated is carried out from diluted solutions thanks an in-situ drying of the deposited drops. This process gives immobilisation densities of 4x10 puis. 11 strands/cm2. These substrates allow to hybrid complementary oligonucleotides and large double strands PCR fragments (1. 5 kb). The covalent grafting allows to use these devices in successive hybridization-denaturation cycles.