Nouvelles approches pour la genèse et le criblage d'anticorps anti-idiotypiques à activité protéase

par Dominique Pillet

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Alain Friboulet.

Soutenue en 2001

à Compiègne .

mots clés

• Anticorps
• Peptidases
• Idiotypes
• Subtilisine
• Enzymes

Résumé

Les anticorps catalytiques sont des molécules biologiques alliant reconnaissance spécifique et catalyse. L'induction de tels anticorps, et plus particulièrement d'anticorps à activité protéase, présente aujourd'hui un grand intérêt tant pour la recherche appliquée (industrie chimique, applications thérapeutiques, …) que pour la recherche fondamentale (compréhension des mécanismes catalytiques). Deux anticorps à activité protéase ont pu être induits par le biais du réseau idiotypique. Cette approche consiste à produire, dans un premier temps, un anticorps primaire ou Ab 1, anti-site actif de l'enzyme modèle, ici la subtilisine Carlsberg. Cet Ab 1 est alors utilisé, dans un deuxième temps, comme immunogène afin d'obtenir des anticorps anti-idiotypiques ou Ab 2, portant l'image interne du site actif de l'enzyme et susceptible de mimer son activité catalytique. L'Ab 1 choisi, l'anticorps 5H3'-H4 anti-subtilisine Carlsberg, présente une très forte affinité pour l'enzyme (EC50 = 3,2 nM) et surtout inhibe son activité catalytique (1< K1 <10 nM) : H reconnaît donc la protéase dans la région de son site actif. Il a servi de matrice pour la genèse de deux anticorps anti-idiotypiques à activité protéase, l'anticorps 6B8E12 chez des souris de type balb/c et l'anticorps 1C5C3 chez des souris ` Biozzi'. La caractérisation de leurs activités respectives a pu être réalisée grâce à la mise au point de différents systèmes de détection de l'activité protéase, originaux et très sensibles. Parmi eux, le système IBSA-FITC' utilisant comme substrat l'albumine sérique bovine modifiée permet de détecter des concentrations en subtilisine Carlsberg de l'ordre de 0,05 nM et en anticorps de l'ordre de 200 nM. Le comportement d'hydrolyse de ce substrat présenté par chacun des deux anticorps induits est particulier et met en avant la diversité exprimée par ces nouveaux biocatalyseurs.

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