Evaluation de la stratégie planticorps comme méthode de lutte contre les mollicutes phytopathogènes : Action in vitro d'anticorps recombinants sur Spiroplasma citri : Résistance de tabacs exprimant des anticorps recombinants à l'infection par le phytoplasme du stolbur

par Sylvie Malembic

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et médicales. Biologie-Santé

Sous la direction de Monique Garnier.

Soutenue en 2001

à Bordeaux 2 .

mots clés

• Phytoplasmes -- Lutte contre
• Phytoplasmoses -- Lutte contre
• Transgénose
• Immunoglobulines
• Nicotiana tabaccum -- Résistance aux maladies

Résumé

Les phytoplasmes, bactéries phytopathogènes sans paroi de la classe des mollicutes, sont localisés exclusivement dans le phloème et ont résisté à la mise en culture. Responsables de nombreuses maladies de plantes, aucun moyen de lutte curative n'existe à ce jour. Une strátégie de lutte par transgénèse a été entreprise au laboratoire. Elle consiste à exprimer une immunoglobuline Ig) recombinante de type scFv spécifique du phytoplasme du stolbur, dans le tabac, hôte du phytoplasme. Afin d'évaluer l'efficacité de cette stratégie, nous avons étudié l'action des Ig sur le mollicute phytopathogène cultivé Spiroplasma citri. Nous avons montré que, tant les Ig natives que les scFv, dirigés contre la protéine majeure de sa surface, inhibent la multiplication de ce microorganisme. Nous avons ensuite réalisé l'ingénierie de scFv anti-stolbur pour leur expression dans le tabac suivant les voies d'adressage apoplastique (tabacs 35-pel-scFv et RSS-scFv-KD), afin d'évaluer la production des anticorps dans la sève élaborée où sont localisés les phytoplasmes. Nous avons mis en évidence que les tabacs 35-pel-scFv produisent les scFv en quantité importante mais ne montrent qu'une résistance transitoire à la maladie, les anticorps n'étant probablement pas ou peu adressés vers la sève élaborée. En effet, il a été récemment montré que les protéines de la sève sont produites dans le cytoplasme des cellules compagnes pour transiter via les plasmodesmes vers le tube criblé. Les tabacs pour lesquels l'expression du scFv est ciblée vers le cytoplasme de façon constitutive (35-scFv) ou spécifiquement dans les tissus du phloème (RSS-scFv-KD), malgré un bon niveau de transcription des ARNm du scFv, ne produisent pas d'anticorps détectables et résistent peu à la maladie. Les anticorps sont donc efficaces in vitro pour inhiber la croissance des mollicutes phytopathogènes, mais leur ciblage vers la sève élaborée s'avère difficile. Différentes stratégies envisagées pour optimiser ce ciblage sont discutées.

Titre traduit

Evaluation of the plantibody strategy for the control of phytopathogenic mollicutes : in vitro effect of recombinant antibodies on Spiroplasma citri and resistance of tobacco plants expressing anti-stolbur scFv to phytoplasma infection

Résumé

Phytoplasmas are phloem-restricted wall-less bacteria of the class mollicutes which have resisted in vitro cultivation so far. They are responsible for numerous plant diseases and there is no curative method for disease control. An antibody-based resistance method is evaluated in our laboratory for the stolbur phytoplasma. It consists in expressing scFv recombinant immunoglobulins (Ig) specific for this phytoplasma in tobacco plants, natural hosts for this pathogen. First we demonstrated that both native Ig and recombinant scFv, specific for the major surface protein of the culturable phytopathogenic mollicute Spiroplasma citri, inhibit its growth in vitro. Secondly, we engineered various anti-stolbur scFv constructions for their expression in tobacco plants via the apoplastic (35-pel-scFv plants) or symplasmic (35-scFv and RSS-scFv-KD) pathway, to evaluate their production into the phloem sap were phytoplasmas are located. Our results indicate that scFv, although produced in large amounts in 35-pel-scFv tobaccos, were probably not, or only slightly, present in the phloem sap. Only a transient disease resistance was observed in these plants. Indeed, it has been recently demonstrated that many phloem sap proteins are produced in the cytoplasm of companion cells and that they move towards sieve tubes via plasmodesmatas. Transgenic tobaccos plants in which scFv expression was targeted to the cytoplasm either constitutively (35-scFv) or specifically to phloem tissues (RSS-scFv-KD), in spite of a good transcription of scFv mRNAs, did not produce detectable amounts of scFv. These tobaccos, as previously, showed little resistance to the disease. As scFv inhibit in vitro growth of phytopathogenic mollicutes, the plantibody strategy appears to be well adapted to control phytoplasma diseases. However, targeting scFv in the phloem sap has to be optimized and various alternatives for sap targeting are discussed.