Nouvelles perspectives pour le diagnostic et la thérapie des pathologies myocardiques et thrombotiques : obtention d'anticorps monoclonaux humains recombinants

par Marie-Josée Jacobin-Valat

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et médicales. Biologie-Santé

Sous la direction de Gisèle Clofent-Sanchez.

Soutenue en 2001

à Bordeaux 2 .

mots clés

• Myocarde -- Maladies -- Diagnostic
• Thrombose -- Diagnostic
• Immunoglobuline M -- Purification
• Myocarde -- Maladies -- Thérapeutique
• Thrombose -- Thérapeutique
• Anticorps monoclonaux

Résumé

Le suivi immunoscintigraphique des pathologies myocardiques et le traitement des pathologies coronariennes nécessitent le développement de nouvelles sondes injectables à l'homme sans danger. D'où notre intérêt pour les AcM. Ainsi l'IgM humaine B7 anti-myosine obtenue par l'équipe de recherche, présente un potentiel dans la détection des nécroses myocardiques et le diagnostic précoce d'éventuels rejets de greffe. Les applications cliniques nécessitant une clairance et une pénétration tissulaire optimum, des fragments scFv ont été élaborés par ingénierie moléculaire. Dans le cadre des pathologies coronariennes, les antagonistes de l'intégrine αIIbβ3 ont suscité l'intérêt en tant qu'outil de diagnostic et de thérapie des thromboses. L'AcM murin XIIF9 spécifique de la conformation de l'αIIbβ3 exprimée sur les plaquettes activées, présente une bonne fixation ex vivo des thrombi sur un modèle animal de l'athérosclérose. Les antagonistes, en inhibant la formation du complexe αIIbβ3 /fibrinogène, réduisent les épisodes thrombotiques chez les patients à risque. Trois banques combinatoires humaines d'anticorps ont été développées à partir des cellules B de patients immunisés contre l'intégrine αIIbβ3 lors de pathologies telles la Thrombasthénie de Glanzmann (EB) ou le Purpura Thrombopénique AutoImmun (TE et BO). Des phages-anticorps recombinants spécifiques de l'intégrine sous sa conformation activée, ont été isolés selon la méthode d'expression de fragments d'anticorps à la surface de phages filamenteux. Notre étude a montré la nature polyclonale de la réponse immunitaire développée, la pathogénicité des auto-anticorps déterminée par l'accumulation de mutations au niveau des régions CDRS et l'émergence de motifs récurrents au niveau des CDR3H. De plus, le potentiel d'inhibition de l'agrégation plaquettaire des formes solubles scFv de certains clones a été clairement démontré lors d'études d'affinité et d'inhibition par le fibrinogène.

Titre traduit

New perspectives for diagnosis and treatment of myocordial pathologies and acute coronary syndrome : obtention of human monoclonal recombinant antibodies

Résumé

Scintigraphic studies of myocardial pathologies and the treament of Acute Coronary Syndrome (ACS) show the necessity to obtain a new class of agents that could be injected in humans without provoking the immune system. It's the reason why we chose to study the diagnostic and therapeutic potential of human mAbs. The ability of a monospecific human IgM Mab (B7) obtained by the research team, to bind to human heart myosin suggests that this mAb may be useful in the imaging of mycordial necrosis after myocarditis of graft rejection. Owing to the fact that the parent molecule is an IgM, the scFv fragment were constructed by molecular ingineering to alleviate problems such as a poor diffusion and a slow penetration inside necrotic myocytes. For a purpose of detection of newly formed thrombi, we determined the feasibility of imaging thrombi using a 123-I labeled murine Mab XIIF9 in an atherosclerotic rabbit model of acute arterial thrombosis. This Mab presented with high affinity and specificity for αIIbβ3 expressed on activated platelets holds promise for ACS imaging. Moreover, we have made a great deal of efforts towards developping αIIbβ3 inhibitors that block fibrinogen inducing platelet aggregation and have a more significant impact for therapeutic management of patients with ACS than currently used αIIbβ3 antagonists. We have succeeded in generating three libraries of single-chain antibodies (TE, EB and BO) from the B cells of patients with Glanzmann's Thrombasthenia or AutoimmuneThrombocytopenic Purpura developing in their sera antibodies against the αIIbβ3 integrin. We obtained several specific recombinant phage-antibodies stemmed from studied patients by phage display of single-chain antibodies on the surface of filamentous phage, some of them recognising the activated form of the integrin. A first important conclusion issuing from our results is that the immune reaction occurring during these diseases consists of a polyclonal hypermutations displayed in the complementarity-determining regions by anti-αIIbβ3 fragments supports the hypothesis of the pathogenesis of developing antibodies. Thirdly, CDR3H analysis of phage-antibodies points out recurrent patterns. Affinity studies and assays for inhibition of platelet aggregation clearly show the therapeutic potential of some of these recombinant antibodies.