Caractérisation pharmacologique et moléculaire du récepteur de la sérotonine des cellules de la granulosa humaine

par Christophe Graveleau

Thèse de doctorat en Endocrinologie et interactions cellulaires

Sous la direction de Amal Kumar Mukhopadhyay.

Soutenue en 2000

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) (autre partenaire) .

Le président du jury était Micheline Misrahi.

Le jury était composé de Micheline Misrahi, Bernard Jégou, Yves Combarnous, Joël Bockaert.

Les rapporteurs étaient Bernard Jégou, Yves Combarnous.

mots clés

• Récepteur h5-HT
• Agonistes parfaits
• Variation de la transcription
• Récepteurs de la sérotonine
• Adénylate-cyclase
• AMP cyclique
• Cellules lutéales
• Cellules de la granulosa
• Isoformes de protéines

Résumé

La sérotonine (5-HT) est présente au niveau du fluide folliculaire humain (Bodis J 1992), et stimule la production de progestérone des cellules lutéales de la granulosa humaine ou CLGH (Bodis J 1993) par un mécanisme inconnu. Ce projet m'a été attribué afin decaractériser l'action de 5-HT sur les CLGH. Les résultats du séquençage attestent de la présence au niveau des CLGH de l'intégralité messager spécifique du récepteur h5-HT7. L'analyse par la technique de Northem blo révèle une transcription du récepteur h5-HT7 avec un taux inversement proportionnelle à la durée de culture des CLGH. La présence homogène des trois variants d'épissage, h5-HT7a, h5-HT7b et h5-HT7d a pu être démontrée au niveau des CLGH, en utilisant les techniques de RT­ PCR et de Southem blot. Le test de l'adénylate cyclase sur préparation membranaire des CLGH indique une stimulation enzymatique obtenue avec les agonistes classés ci-dessous par ordre d'affinité décroissante : 5-CT (pEC5o = 9,49 ± 0,20) > 5-MT (pEC5o = 8,09 ± 0,50 ≥ 5-HT (pEC5o = 7,97 ± 0,18) et une inhibition de la stimulation enzymatique par 5-HT avec la miansérine, la clozapine, l'amoxapine, le butaclamol et la loxapine. Ces résultats, confirmés par le test de l'AMPc directement sur les cellules, démontrent la présence fonctionnelle de récepteurs h5-HT7 au niveau des CLGH. Une régulation négative de 5-HT sur la stimulation par hCG de la production d'AMPc a été démontré au niveau des CLGH. De plus, j'ai démontré une forte concentration (Bmax = 3,41 pmol mg- 1) de sites de liaisons de 5-HT sur la membrane des CLGH, avec un pK1 = 9,49 et un pK0 = 9,48 similaires aux constantes du récepteur hS-HT7. Un synergisme avec l'ANP sur la stimulation par 5-HT de la production de progestérone des CLGH a aussi été observé. En conclusion, cette étude démontre la présence, au niveau des CLGH, des récepteurs h5- HT7a, h5-HT7b eth5-HT7d, qui, une fois activés, déclenchent la stimulation de l'adenylate cyclase, la production d'AMPc et la sécrétion de progestérone par les CLGH en culture. Ce résultat assigne pour la première fois un rôle du récepteur 5-HT7 dans la stéroïdogénèse ovarienne.

Titre traduit

Pharmacological and molecular characterization of the serotonin receptor from the human granulosa cells as the h5-HT7 receptor

Résumé

The serotonin (5-HT) is present in the human follicular fluid (Bodis J 1992) and stimulates the production of progesterone from the human granulosa lutein cells or HGLC (Bodis J 1993) by an unknown mechanism. The project attributed to me consisted of characterizing the action of 5-HT on HGLC. Sequence data revealed the presence by HGLC of the entire mRNA specifie of the h5-HT7 receptor. Northem analysis confirmed a transcription ofh5-HT7 receptor from HGLC, with a rate inversely proportional to the duration of culture. I could also demonstrated the presence of the three splice variants h5-HT7a, h5-HT7b and h5-HT7ct using RT-PCR and Southem blotting. The adenylate cyclase assay on HGLC membrane preparation revealed an enzymatic stimulation obtained with agonists classified below in a rank order of affinity : 5-CT (pECso = 9,49 ± 0,20) > 5-MT (pEC5o = 8,09 ± 0,50);::: 5-HT (pEC50 = 7,97 ± 0,18) and an inhibition of 5-HT-stimulation with mianserin, clozapine, amoxapine, butaclamol and loxapine. This data, confirmed by cAMP assay directly on cells, demonstrates the functional presence of h5-HT7 receptor on hGLC. A negative regulation of 5-HT on hCG­ stimulated cAMP production could be demonstrated on the HGLC. Further, I demonstrated a high concentration of 5-HT-binding sites (Bmax = 3,41 pmol mg-1) on membrane from hGLC with pK0 = 9,48 and pK1 = 9,49 similar to the constant of the h5-HT7 receptor. A synergism with the ANP on 5-HT-stimulated progesterone production from HGLC was also observed. In conclusion, I have demonstrated within the HGLC, the presence of the h5-HT7 a, h5-HT7b and h5-HT7d , receptors that, once activated, trigger off the adenylate cyclase stimulation, cAMP production and progesterone production by cultured hGLC. This results assign for the first time an ovarian steroidogenic role to the 5- HT7 receptor.