Distribution des genes impliques dans la voie de la biosynthese de la methionine et construction du premier vecteur navette replicatif chez les leptospires

• Auteur / Autrice : Pascale Bourhy
• Direction : Isabelle Saint-Girons
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées. Sciences médicales
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

Les leptospires sont des spirochetes caracterises par un genome constitue de deux chromosomes, ci et cii et dont la genetique est inexistante. Pour mieux comprendre l'organisation et la fonction des genes chez ces bacteries, nous avons etudie la voie de biosynthese de la methionine. Nous avons tout d'abord isole les genes metx et mety de leptospira meyeri, une espece saprophyte, par complementation de mutants d'escherichia coli. Nous avons montre que ces genes sont organises en operon et localises sur le grand chromosome ci. L'analyse de la sequence de metx, associee a l'analyse enzymatique du produit de metx nous a permis de demontrer que la premiere etape de la voie de biosynthese de la methionine est catalysee par une homoserine-o-acetyltransferase, comme chez la levure et non par une homoserine-o-succinyltransferase presente chez e. Coli. Nous avons alors caracterise la methylene tetrahydrofolate reductase (catalysant une etape tardive de la voie) provenant d'une espece pathogene, l. Interrogans. Cette enzyme, fonctionnelle chez un mutant metf d'e. Coli, est thermosensible. Le gene metf appartient au petit chromosome cii. L'ensemble de ces resultats indique une dispersion des genes methionine sur les deux chromosomes de leptospira sp. Afin de developper un vecteur navette l. Biflexa-e. Coli, nous avons utilise le leptobacteriophage le1, phage tempere se repliquant de facon autonome, tel un plasmide. Ce vecteur navette est un plasmide d'e. Coli, comprenant un marqueur de resistance a la kanamycine d'enterococcus faecalis, bacterie a gram-positif ainsi qu'un fragment de 5,2 kb de le1. L'origine de replication de le1 contenue dans ce fragment, a ete caracterisee au niveau nucleotidique. Ce resultat encourageant fait etat