L'alternane-saccharase de leuconostoc mesenteroides nrrl b-1355 : structure primaire et synthese d'oligosides

par MARTHA ALICIA ARGUELLO MORALES

Thèse de doctorat en Biologie, santé, biotechnologie. Microbiologie

Sous la direction de Pierre Monsan.

Soutenue en 2000

à Toulouse, INSA .

mots clés

Résumé

L'alternane-saccharase est une glucane-saccharase excretee par l. Mesenteroides nrrl b-1355. En presence de saccharose, l'enzyme catalyse la synthese d'alternane, un polymere compose de residus glucose associes par des liaisons osidiques 1,6 et 1,3 alternees. De plus, lorsqu'un accepteur tel que le maltose est ajoute dans le milieu, l'alternane-saccharase catalyse le transfert du glucose provenant du saccharose sur l'accepteur pour produire des oligosides de faible masse molaire egalement porteurs de liaisons 1,6 et 1,3 alternees. L'etude realisee a porte sur deux aspects. Tout d'abord, le clonage du gene codant pour l'alternane-saccharase a ete entrepris afin de comparer la structure primaire de cette enzyme aux autres glucane-saccharases connues de specificite differente. En parallele, la reaction en presence de differents accepteurs catalysee par l'alternane-saccharase a ete etudiee afin de cerner l'interet de cette enzyme pour la synthese de nouveaux oligosides. Les premiers travaux de clonage nous ont conduits a isoler un gene codant pour une dextrane-saccharase (dsr-c). Le gene codant pour l'alternane-saccharase (asr) a ete isole a l'aide d'une sonde specifique de la proteine. Les deux genes ont ete sequences et les proteines codees ont ete caracterisees. Le gene dsr-c est identique au gene dsr-b de l. Mesenteroides nrrl b-1299 indiquant que les deux genes proviennent du meme ancetre. L'analyse de la sequence proteique codee par le gene asr a permis d'identifier des segments absents dans les sequences des autres glucane-saccharases, ainsi que des segments differents. Ces regions pourraient etre impliquees dans la specificite de l'enzyme. L'activite alternane-saccharase en presence de differents oses accepteurs a ete comparee a celle de la dextrane-saccharase de l. Mesenteroides nrrl b-512f qui ne synthetise que des liaisons osidiques de type 1,6. Il est apparu de nombreuses differences entre l'alternane-saccharase et la dextrane-saccharase vis a vis des molecules testees, certaines etant mieux reconnues par une enzyme que par l'autre. En particulier, le cellobiose qui etait identifie comme un mauvais accepteur pour la dextrane-saccharase est apparu comme etant efficacement glucosyle par l'alternane-saccharase, avec un rendement de 30%. Les produits obtenus ont ete purifies et leurs structures determinees.

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