Effets du monoxyde d'azote et du peroxynitrite sur la sous-unite r2 de la ribonucleotide reductase murine

par OLIVIER GUITTET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Michel Lepoivre.

Soutenue en 1999

à Paris 11 .

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Résumé

Le monoxyde d'azote (no) est une molecule radicalaire, produite chez les mammiferes a partir de la l-arginine par un groupe d'enzymes, les no synthases (nos). Induite par des cytokines ou des produits bacteriens, l'activite nos ii des macrophages murins est la cause principale de leur action antitumorale. No provoque la cytostase des cellules cibles en inhibant le fonctionnement de la ribonucleotide reductase (rnr), qui controle la vitesse de synthese de l'adn. No detruit un radical tyrosinyle indispensable a l'activite situe sur la sous-unite r2 de la rnr. En utilisant in vitro des methodes spectroscopiques (rpe, uv-visible), nous avons montre que no se couple d'abord au radical tyrosinyle de la sous-unite r2 murine. La disparition du radical entraine la labilisation du centre diferrique adjacent, qui contribue a la formation et a la stabilite du radical. L'etat de la tyrosine influence donc en retour la stabilite du centre metallique. Le peroxynitrite (onoo -), derive oxyde de no potentiellement cytotoxique, induit aussi la perte du complexe metal-radical de la proteine r2 murine. Cependant, l'effet de no est spontanement reversible, au contraire de celui de onoo -, irreversible. Une analyse par spectrometrie de masse et sequencage de peptides trypsiques a montre que la nitration de residus tyrosine de r2 par onoo - est a l'origine de la perte du radical et de l'activite enzymatique. La portee physiologique de ces resultats a ete etudiee dans un modele de coculture cellulaire. En l'absence de pma, un activateur de la nadph oxydase, l'activite nos ii de macrophages peritoneaux murins entraine la disparition complete et fortement reversible du radical dans une lignee leucemique murine. Une concentration de tpa induisant un flux d'o _ 2 equivalent a celui de no provoque la production de onoo -. Apres stimulation des macrophages par le pma, la destruction du radical reste reversible. No lui-meme est donc le principal effecteur physiologique de l'inhibition de la rnr.

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