Etude par chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) des relations structure/fonction de l'alpha-chymotrypsine bovine native et glycosylée chimiquement

par Kai You Jiang

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Mookambeswaran A. Vijayalakshmi.

Soutenue en 1999

à Compiègne .

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Résumé

Dans ce travail, nous avons effectué l'étude de la relation structure/fonction de la chymotrypsine bovine pancréatique glycosylée chimiquement par la glucosamine par l'utilisation de ces interactions avec des ions métalliques immobilisés. La méthode de glycosylation avec la protection de site actif par N-acétyl-L-tyrosinamide a permis de récupérer 75% de protéine et la quantité de sucre couplée covalement a varié de 3 à 6 résidus par mole. Cette modification chimique a diminué considérablement l'activité enzymatique de chymotrypsine. La perte de l'activité peut être expliquée par les changements conformationnelles dans le site de liaison au substrat. Les changements importants dans l'accessibilité de deux résidus histidine His 57 du site actif et His 40 du site de liaison au substrat ont été étudiés par les interactions de protéine avec le Cu (Il) immobilisé en utilisant deux méthodes : la chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) et l'électrophorèse capillaire d'affinité avec ions métalliques immobilisés (IMACE). La glycosylation semble produire deux populations différentes de protéines. Pour la partie majeure de chymotrypsine, l'absence de l'affinité pour IDA-Cu (Il) a été observée en conditions d'IMAC et IMACE. En même temps, la glycosylation chimique a augmenté l'affinité pour Cu (Il) immobilisé pour une autre partie de chymotrypsine. Dans les deux cas, l'affinité pour le chélate métallique a été estimée par les constantes de dissociation (KD) entre la protéine et le ligand IDA-Cu (Il). Le troisième axe de nos recherches concerne l'analyse de la thermostabilité de M-chymotrypsine après la glycosylation. Dans les conditions habituelles (tampon Tris), aucune augmentation de thermostabilité n'a pas été observée pour l'enzyme glycosylée. Cependant, lorsque le tampon borate est utilisé, nous avons observé un impact bénéfique de la glycosylation sur la thermostabilité de l'enzyme. Cette augmentation de la thermostabilité peut être expliquée par la formation des nouvelles liaisons ester entre les groupements diols des sucres et des ions borate qui joue un rôle de "couche protectrice" autour du site actif de IU -chymotrypsine. Dans ce cadre, l'IMAC a été utilisée pour mesurer l'influence de ces ions sur un changement éventuel de la conformation de protéine. Aucune différence n'a pas été observée entre l'enzyme glycosylée et l'enzyme glycosylée préalablement incubée en présence d'ions borate. Les ions borate influencèrent la thermostabilité de l'enzyme glycosylée uniquement par la stabilisation de sa structure tertiaire.

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