Analyse structurale et immunologique de l'allergène majeur de cheval : Equ c 1 (Equus caballus) membre de la superfamille des lipocalines

par Christophe Grégoire

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Jean-Pierre Dandeu.

Soutenue en 1999

à Compiègne .

mots clés

• Cheval
• Allergie -- Aspect Immunologique
• Allergènes
• Allergie aux phanères
• Séquence nucléotidique
• Homologie (biologie)
• Structure moléculaire
• Déterminants antigéniques

Résumé

L'exposition aux squames d'animaux présents dans notre environnement est connue pour être une cause fréquente d'allergie. L'inhalation de ces allergènes potentiels induit la synthèse d'IgE permettant le développement ultérieur d'asthme chez des individus dit « atopiques ». Les raisons pour lesquelles une protéine est allergénique ne sont pas, à ce jour, clairement définies ; cependant certains auteurs ont émis de nombreuses hypothèses sur les liens qui existeraient entre la structure et fonction de la protéine et son implication dans les processus allergiques. Dans une première partie, cette étude s'est intéressée à l'identification et la purification des quatre allergènes présents dans les phanères de l'animal et majoritairement incriminés dans la sensibilisation allergique. Nous avons pu y déterminer la présence d'un allergène majeur, equ c 1, capable de provoquer une réaction allergique de type I chez la totalité des patients. Dans une seconde partie, le gène codant pour l'allergène majeur de cheval a été cloné à partir des glandes salivaires sublinguales de l'animal par RT-PCR et une forme recombinante a été exprimée dans un hôte bactérien (rSLG equ c 1). La séquence complète d'equ c 1, longue de 923 nucléotides, possède un cadre ouvert de lecture de 560 nucléotides codant pour une chaîne polypeptidique de 187 acides aminés. L'analyse de la séquence à permis d'identifier equ c 1 comme un nouveau membre de la superfamille des lipocalines, parmi laquelle de nombreux allergènes sont déjà répertoriés. Le repliement tridimensionnel des lipocalines est constitué de huit brins prolongés par une hélice alpha. Les feuillets disposés sur deux plans antiparallèles forment un tonneau au centre duquel se trouve une cavité hydrophobe susceptible d'accueillir un ligand hydrophobe. Des résultats comparant l'immunoréactivité d'equ c 1 naturel et recombinant en immunodétection et en inhibition d'ELISA suggèrent que la protéine recombinante exprime la majorité des épitopes présents sur la forme naturelle de l'allergène. Des expériences de sédimentation à l'équilibre et de gel filtration ont montré que la forme glycosylée d'equ c 1 naturelle et déglycosylée de rSLG equ c 1 était dimérique en solution, mais aussi à l'état cristallin selon l'analyse cristallographique de rSLG equ c 1 à 2. 3 A de résolution. Cette étude s'inscrit comme une étape préalable indispensable à une validation de notre modèle d'étude pour investiguer ultérieurement l'allergénicité d'equ c 1.

Résumé

Exposure to animal danders, commonly present in the environnement, is known to be a frequent cause of allergy. The inhalation of these potent allergens induces immunoglobulin E (IgE) and subsequent development of astma in atopic individuals. The reasons why a protein is allergenic are not clearly understood to date, although several authors favor the hypothesis of a possible relationship between the structure and the function of proteins and their allergenicity, as it has been assumed for the enzymatic activity of certain allergens to have the capacity to clive the CD23 and CD25 at cells membrane and enhance the IgE response. The topic of this study is the caracterisation of the horse allergens present in horse sweat and the obtention of a model available to understand their potentiel intrinsic property involved in allergie reactions. In a first time, we identified and purified four allergens in horse dander extract, with a molecular mass (Mr) range between 10 000 and 75 000 and isoelectric points (pl between 3. 5 and 4. 5, and determined a major allergen, Equ c 1 (Equus caballus), that elicit an IgE-mediated type I allergic reaction in 100 percent of a selected group of patients. In a second time, the gene enconding the major horse allergen was cloned from total cDNA of sublingual salivary glands by RT-PCR and a recombinant form expressed in Escherichia colt. The full-lenght sequence of u c 1 is 923 nucleotides long with open reading frame of 560 nucleotides coding for a single polypeptide of 187 amino acid protein. The sequence comparaisons reveal that Equ c 1 is a new member of the lipocalin superfamily, known to include several allergens. The lipocalins fold essentially consists of an eight-stranded B barrel formed by two perpendicular sheets and followed by a C-terminal a helix. A central hydrophobie cavity within the barrel encloses the ligand binding site in RBP, OBP and 1MUP, and presumably in other members of the family. A recombinant protein was compared with natural Equ c 1 for its recognition by antibodies raised against the natural Equ c 1 in immunoblots and in inhibitionlcompetition enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). These results suggest that the bacterial expressed protein (rSLG Equ c 1) present the IgE epitopes of the natural allergen. The recombinant form of Equ c 1 has been crystallysed at 2. 3 Â resolution as homodimer. Equilibrium sedimentation and gel filtration studies demonstrate that both the glycosylated form of u c 1 purified from salivary glands and the non-glycosylated recombinant form expressed in bacteria exist too predominantly as dimer in solution. This work allows us to continue our investigations on the mechanims of some allergenic lipocalines like u c 1 could influence the IgE synthesis. As a first step towards the understanding of the physiological role and "allergenic" properties of lipocalins, we report here, the caracterisation, the cloning and crystallographic analysis of this major horse allergen : Equ c 1.