Analyse mutationelle et etude de la regulation du gene prnb implique dans le transport de la proline chez aspergillus nidulans

Mutational analysis and regulation of the prnb gene coding for a proline permease in aspergillus nidulans

• Auteur / Autrice : Uygar H. Tazebay
• Direction : Claudio Scazzocchio
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Le travail realise au cours de cette these a consiste dans l'analyse mutationnelle et l'etude de la regulation du gene prnb codant pour la permease specifique de la proline chez le champignon filamenteux a. Nidulans. Dans la premiere partie, la position des introns qui se trouvent dans le gene prnb a ete identifie par le sequencage de l'adnc et la sequence proteique de la permease codee par ce gene a ete etablie. La position probable des domaines transmembranaires a ete determinee en utilisant les criteres de persson et argos (1994) et un modele de la topologie membranaire de prnb a ete propose. Une approche mutationnelle pour etudier les relations structure-fonction de prnb a ete choisie. Plusieurs alleles mutes de prnb qui suppriment la sensibilite des souches sasa ou des souches prnd a la proline, ont ete sequences. De plus, nous avons etudie le role de certains acides amines conservees parmi les permeases de la proline des eucaryotes inferieurs par mutagenese dirigee sur prnb in vitro. Ces etudes nous ont conduit a l'identification de certains domaines important pour la stabilite ou pour le fonctionnement de prnb. Au cours de ces travaux, un systeme de transformation (une souche receptrice et un plasmide cassette) qui permet d'identifier facilement un evenement de remplacement de prnb par de l'adn exogenique a ete construit. Dans la deuxieme partie de ce travail, une methode rapide qui permet d'etudier avec precision l'incorporation de substances dans les cellules d'a. Nidulans, a ete etablis. Cette methode a ete utilisee pour analyser la vitesse de transport de la proline par prnb, et par la (les) permease(s) secondaire(s). Par ces travaux, l'inhibition de prnb par la proline et par d'autres acides amines a ete montree, et les parametres cinetiques de cette permease ont ete etablis. En utilisant la technique que nous avons developpe, nous avons observe une augmentation transitoire du transport de la proline par prnb en debut de formation du mycelium. Nous avons montre que cette augmentation est independante de la presence de proline dans le milieu de pre-culture. Dans la troisieme partie, il a ete etabli que l'augmentation de l'activite de transport de la proline au cours de la germination est liee a l'augmentation de la transcription du gene prnb. Au cours des etudes concernant la nature du signal d'activation, il a ete montre que la transcription de prnb est activee en conditions de carence en acides amines (en histidine ou en proline) independemment du stade de developpement. Cette activation en condition de carence depend de la sequence 5'-tgactca-3' qui se trouve dans le promoteur de ce gene. Cette sequence est le consensus du site de fixation des activateurs cpca/gcn4p qui regulent les genes des voies de la biosynthese des acides amines respectivement chez n. Crassa et s. Cerevisiae (hinnebusch, 1988 ; sachs, 1996), ce qui suggerent qu'en condition de carence en acides amines, le gene prnb peut etre active par un facteur homologue de gcn4p. Nous avons montre que l'activateur specifique des genes du catabolisme de la proline, prna, contribue egalement a l'activation de transcription de prnb dans certaines conditions de carence en acides amines. Il a ete montre que le mecanisme qui agit au cours de la germination des conidiospores est independant de prna et de cpca. Un deuxieme mecanisme qui est totalement independant de prna, et dependant du site 5'-tgactca-3', agit sur l'expression de prnb en condition de carence etablie par l'addition de 3-aminotriazole (3-at). Un troisieme mecanisme qui est dependant de prna, agit en condition de carence en acides amine (en proline et en histidine) quand cette carence est creee par le transfert des cultures du milieu complet vers un milieu minimum.