L'alcool cinnamylique déshydrogénase d'Eucalyptus gunnii : caractérisation moléculaire de la protéine et analyse fonctionnelle du promoteur

par Virginie Lauvergeat

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire végétale

Sous la direction de Jacqueline Grima-Pettenati.

Soutenue en 1997

à Toulouse 3 .

mots clés

Résumé

L'alcool cinnamylique deshydrogenase (cad, ec 1. 1. 1. 195) est une enzyme cle dans la biosynthese des monolignols, precurseurs monomeriques des lignines. La cad2 d'eucalyptus gunnii appartient a la famille des alcools deshydrogenases a longue chaine et a zinc. L'existence simultanee d'un modele moleculaire et d'un systeme de production de cad2 recombinante et fonctionnelle chez escherichia coli, nous a permis d'envisager des experiences de mutagenese dirigee d'acides amines potentiellement impliques dans la catalyse enzymatique. Nous avons dans un premier temps optimise le niveau de production puis mis au point un protocole de purification de l'enzyme recombinante. La mutation du residu serine 212 en aspartate, a permis de montrer que cet acide amine est implique dans la reconnaissance du groupement phosphate du cofacteur nadph et joue donc un role determinant dans la specificite de la cad2 vis a vis du nadph. En parallele, nous nous sommes interesses a l'analyse de la regulation transcriptionnelle du promoteur de la cad2 d'eucalyptus. Nous avons realise une fusion transcriptionnelle du promoteur avec le gene rapporteur de la -glucuronidase que nous avons introduite dans deux systemes heterologues, un angiosperme ligneux perenne, le peuplier et un angiosperme annuel herbace, le tabac. L'analyse des tissus exprimant l'activite gus dirigee par le promoteur en fonction du developpement et en reponse au stress blessure, montre que dans la majorite des cas ces tissus synthetisent activement des lignines, et d'autre part, que le promoteur cad2 est inductible par la blessure. Au cours de ce travail, nous avons ete amenes a metre au point un protocole de revelation de l'activite gus adapte a l'anatomie particuliere du cambium des plantes ligneuses. L'analyse de deletions en 5' du promoteur a permis de mettre en evidence des regions impliquees dans la regulation de l'expression du gene dans les tissus vasculaires. La region -341/-124 pb, qui est necessaire a l'expression du gene dans les tissus vasculaires et les extremites racinaires, est capable de lier specifiquement des proteines nucleaires de tiges de tabac. Elle contient un element ac conserve chez de nombreux promoteurs de genes de la voie de biosynthese des phenylpropanoides, suggerant que des mecanismes communs puissent reguler l'expression de ces genes.

Titre traduit

Eucalyptus cinnamyl alcohol dehydrogenase : molecular caracterisation of the protein and promoteur functional analysis

Pas de résumé disponible.